一個可擴展的(de)骨(gu)芯片(pian)模型，用(yong)于研究(jiu)特定(ding)于骨(gu)的(de)細胞植入和組織修復

總部設在芬蘭奧盧的器官芯片制造商 AKITA，by Finnfadvance ，成立于2019年。搭載擁有高通量器官芯片板，可被設計成單器官和多器官，兼容幾乎各成像模式，高人體相關性的下一代人體體外模型，加速藥物開發，降低臨床前試驗失敗的風險，也可用于個性化醫療。上海曼博生物醫藥科技有限公司是AKITA，by Finnfadvance授權的中國經銷商。

AKITA背(bei)景介紹

早期研(yan)究中(zhong)的傳(chuan)(chuan)統(tong)體外方法在評(ping)估人體藥物或療法時提供(gong)的結果(guo)可靠性較差(cha)。這些方法使用(yong)傳(chuan)(chuan)統(tong)的2D細胞(bao)培養在塑(su)料或玻璃基質(zhi)上，部分復(fu)(fu)制了應(ying)用(yong)于組織的復(fu)(fu)雜細胞(bao)外基質(zhi)和(he)機械力（Yuste等，2021）。

細胞需(xu)要(yao)特定的(de)微生(sheng)理(li)條件和刺激才能像體(ti)內那(nei)樣(yang)發揮(hui)作用(yong)。AKITA Plate被(bei)(bei)設計(ji)(ji)為以可擴展的(de)方(fang)式重現組織(zhi)和生(sheng)物(wu)界面(mian)的(de)微生(sheng)理(li)條件。微流(liu)(liu)控的(de)使用(yong)使得雙向液(ye)流(liu)(liu)增(zeng)強了生(sheng)物(wu)屏障的(de)完整性(xing)和組織(zhi)成熟(shu)。無管道且用(yong)戶友好的(de)AKITA Plates也被(bei)(bei)設計(ji)(ji)為與(yu)當前的(de)體(ti)外骨骼架聯合使用(yong)。

近年來(lai)，各界對(dui)3D細胞(bao)培(pei)養和微生理(li)系統的(de)興趣日益增(zeng)加，主要集中(zhong)在(zai)模擬軟組織(zhi)，導致(zhi)了對(dui)結締組織(zhi)更好的(de)體外表(biao)征的(de)進展有限，包括(kuo)骨(gu)結構，尤.其是骨(gu)的(de)鈣化(hua)部分。

Ossiform專門生產由人類鈣(gai)化骨(gu)中發現的主要(yao)礦(kuang)物(wu)質B-三鈣(gai)磷酸鹽組成(cheng)的生物(wu)陶瓷。他們的技(ji)術目前被(bei)用于體外(wai)和體內的骨(gu)和骨(gu)疾病(bing)研究，為(wei)研究者提供了一(yi)個可(ke)靠(kao)且(qie)可(ke)重復的模(mo)型系統。

盡(jin)管Ossiform的(de)生物(wu)陶瓷被(bei)細胞和(he)哺(bu)乳(ru)動物(wu)認(ren)為是真正的(de)骨骼，但人們依然希望有一個體(ti)外骨模型，它也(ye)能模擬體(ti)內發現的(de)動態營(ying)養流和(he)氧氣傳輸(shu)。

通(tong)過將AKITA Plate的(de)微流控特性與Ossiform的(de)生物陶瓷支架相結合，骨和(he)骨疾病的(de)研究(jiu)者們得到了一個生理相關且受(shou)控的(de)環境，用于研究(jiu)組織再(zai)生，這最.終可(ke)以開(kai)發新的(de)和(he)改進的(de)骨疾病治療方法。

材料(liao)與方(fang)法

01  細(xi)胞培養

人骨骨肉瘤(liu)上(shang)皮細(xi)胞 (U2OS細(xi)胞) 在Dulbecco’s Essential Medium Eagle medium (Sigma-Aldrich) 中培(pei)養(yang)，該培(pei)養(yang)基補充了(le)1%的MEM非必需氨基酸 (Sigma-Aldrich) 、1mm的L-谷氨酰胺 (Sigma-Aldrich) 、1%的青霉(mei)素(su)-鏈霉(mei)素(su) (Gibco) 和10%的胎牛血清 (FBS, Serana) 。對于傳代，使(shi)用了(le)0.25%的胰酶-EDTA (Gibco) 。只有傳代數在10以(yi)下的細(xi)胞被用于這項研究。

人臍靜(jing)脈(mo)內皮細胞(bao) (HUVECs) 在(zai)Endothelial Cell Growth Medium 2 (Promocell) 中(zhong)培(pei)養(yang)，該培(pei)養(yang)基補充(chong)了(le)10%的(de)熱滅活FBS和1%的(de)青(qing)霉(mei)素-鏈霉(mei)素 (Gibco) 。對于傳(chuan)(chuan)代(dai)，使用了(le)0.05%的(de)胰酶-EDTA (Gibco) 。傳(chuan)(chuan)代(dai)數(shu)在(zai)6以下(xia)的(de)細胞(bao)被用于這(zhe)項研究(jiu)。

02  AKITA Bone-on-chip系統

對于類骨(gu)培養，使用了微流控AKITA Plate (Finnadvance) 和多(duo)孔3D打印骨(gu)支(zhi)架 (P3D Scaffolds, Ossiform) 組合(he)。優(you)化的AKITA Plate，384孔板格式，包含96個(ge)獨立的測試單元，在(zai)這些單元中，支(zhi)架在(zai)動態液(ye)流下培養（圖1）。

AKITA bone-on-chip系統(tong)經過(guo)專有表面涂層(ceng)處理，以防止細(xi)胞附著(zhu)到微通道，并允許(xu)細(xi)胞特異(yi)性地附著(zhu)到正在測試的生物支架上。

圖1：AKITA微流(liu)控板設計

03  骨(gu)支架涂(tu)層(ceng)和細胞(bao)接種

多孔3D打印(yin)骨支架(jia) (P3D支架(jia)，Ossiform) 被(bei)(bei)用(yong)來實(shi)(shi)現類似體內的3D細胞(bao)培(pei)養(yang)環境。這些支架(jia)是由B-三鈣磷(lin)酸鹽制造的，也是骨骼的主(zhu)要(yao)成分。為了測試涂層對細胞(bao)附著(zhu)和(he)生存能力的影響(xiang)，支架(jia)在(zai)轉移到AKITA Plate之前，要(yao)么涂有100ng/ml纖維連接蛋白(bai) (PromoCell) 并在(zai)37°C下孵育4小時，要(yao)么不(bu)涂層。無(wu)支架(jia)的AKITA Plate測試孔被(bei)(bei)用(yong)作對照。各條件的實(shi)(shi)驗均有4個技術(shu)重復(fu)。

04  細胞(bao)活(huo)性讀出

為了(le)測(ce)量細胞的(de)(de)生(sheng)長和活(huo)性(xing)，使用(yong)(yong)了(le)Cell Counting Kit-8 (CCK-8，Sigma-Aldrich) 。根據(ju)制造(zao)商的(de)(de)指示，在(zai)細胞播種后的(de)(de)第(di)1、3和6天(tian)進(jin)行了(le)活(huo)性(xing)測(ce)定。簡(jian)單來說，丟棄培(pei)養(yang)基，并用(yong)(yong)1:10比例(li)的(de)(de)CCK-8溶(rong)液：培(pei)養(yang)基替換(huan)。孵育4小時后，從(cong)支架頂部收(shou)集10微(wei)升的(de)(de)樣品(pin)，并在(zai)標準的(de)(de)384孔板中(zhong)用(yong)(yong)5微(wei)升的(de)(de)PBS稀釋。使用(yong)(yong)微(wei)孔板讀數(shu)器測(ce)量450nm的(de)(de)吸光(guang)度。

實(shi)驗(yan)結(jie)果

01  AKITA Plates被用來通過(guo)測量細胞活性，來監測細胞在3D骨支架中的植入(ru)和生長(chang)

因為Ossiform支架的(de)組成接(jie)近骨的(de)細(xi)胞(bao)外基(ji)質(zhi)，我們期望它能促(cu)進骨系U2OS細(xi)胞(bao)的(de)植入。我們還研究了(le)涂層和(he)液流對實(shi)驗結果(guo)的(de)影響(xiang)。

U2OS細胞在無涂層和纖維連接(jie)蛋(dan)白涂層的支架中都顯示出(chu)強大的植入能力(li)，通(tong)過維持6天的培養(yang)期(qi)的活性 (圖2) 。

在無涂層的支架中，細胞的活性被維持，而纖維連接蛋白涂層在實驗時間范圍內提高了細胞增殖。我們觀察到，纖維連接蛋白涂層中的細胞生長被液流增強 (圖2，右側) 。

圖2：在AKITA Plate中培養的Ossiform骨支架中的U2OS細胞活性

U2OS骨系(xi)細(xi)胞在(zai)靜態(tai)和動(dong)態(tai)液(ye)流(liu)條件下都(dou)能在(zai)無涂層(ceng)的(de)骨支(zhi)架上保持活性(xing) (左) 。纖維連接蛋白對(dui)支(zhi)架的(de)涂層(ceng)在(zai)動(dong)態(tai)液(ye)流(liu)下增強了6天培(pei)養期間的(de)細(xi)胞活性(xing) (右) 。數據顯(xian)示為平均值(zhi)±標準偏差，n=4。

02  為研究非骨系列細(xi)胞是否也會在Ossiform，支架中植入，我們(men)測試了(le)人臍靜脈內皮(pi)細(xi)胞HUVECs

血管細胞(bao)在(zai)支架中(zhong)的植入效果(guo)較差，隨著時間的推移，細胞(bao)數量減(jian)少 (圖3) 。纖(xian)維連接蛋(dan)白涂(tu)層僅在(zai)液流條件下緩解(jie)了這種效應，而在(zai)靜態培養中(zhong)未(wei)觀(guan)察到(dao)明顯差異。

重要的(de)是(shi)，液(ye)流沖走了(le)種植在骨支(zhi)架外部的(de)細(xi)胞，這使得我們能夠(gou)特別研究植入的(de)細(xi)胞群(qun)體，并減少了(le)背(bei)景噪聲。實際上，與(yu)靜(jing)態條(tiao)件(jian)相比，液(ye)流幾乎消除(chu)了(le)無支(zhi)架控制液(ye)流中的(de)細(xi)胞活性信號 (圖3) 。

我們(men)還觀察(cha)到，液(ye)流減(jian)少了(le)標準偏差，從而(er)提高了(le)結果(guo)的(de)重復性 (圖3) 。這證(zheng)實了(le)動態液(ye)流改(gai)善(shan)了(le)信噪比以及(ji)重復性，從而(er)提供了(le)更高質量(liang)的(de)數據。此外，它(ta)表(biao)明AKITA bone-on-chip系統特(te)別(bie)促進了(le)骨系列(lie)細胞的(de)生(sheng)長，因此它(ta)模(mo)擬了(le)臨床(chuang)相關的(de)特(te)征(zheng)。

圖(tu)3：在(zai)AKITA Plate中(zhong)培養的Ossiform骨支架中(zhong)的HUVEC細胞活(huo)性

HUVECs在骨支架上的(de)活性隨時間的(de)推移而(er)減少，無論是(shi)無涂層 (左側(ce)) 還是(shi)纖維連接蛋白涂層 (右(you)側(ce)) 。

液流(liu)(liu)降低(di)了無支(zhi)(zhi)架(jia)控制條件(jian)下(xia)的活性(xing)信號，這(zhe)表明液流(liu)(liu)對于(yu)消除源自骨支(zhi)(zhi)架(jia)外部生長的細胞產生的任何背(bei)景噪聲(sheng)是重要的。數據(ju)顯示(shi)為平均值(zhi)±標(biao)準(zhun)偏差(cha)，n=4。

結(jie)論

AKITA Plate的(de)骨芯(xin)片顯示，與非(fei)骨細(xi)胞系 (Huvec) 相比，U2OS成骨細(xi)胞優先(xian)植入。由于其動態液流，AKITA Plate上(shang)的(de)骨芯(xin)片提(ti)高了(le)細(xi)胞活性信(xin)號(hao)/噪聲比和可重復性。

因此，它允許生成高質量數據(ju)，用(yong)于高通量評估骨修復。這種用(yong)戶友好(hao)型模型可靠地用(yong)于基礎(chu)研究、藥物(wu)篩(shai)選和個性化醫學。

參(can)考文獻

Yuste I et. Al. Pharmacological research 169, (2021). DOI 10.1016/j.phrs.2021.105626