用于模擬(ni)具有氣液界面的人肺泡上(shang)皮-內皮屏障的微生理肺芯片模型

簡介(jie)

人(ren)類肺部(bu)對環境變化和遺傳疾(ji)病非常敏感，盡管近(jin)幾十年來醫(yi)學研究發展迅速，但(dan)仍然有許(xu)多嚴重的肺部(bu)疾(ji)病影響著數百(bai)萬患(huan)者，缺乏治愈(yu)或有效的治療(liao)方(fang)法。例(li)如在英國，每(mei)10萬公民就(jiu)至少有12人(ren)因肺纖(xian)維化而死亡[1]。

為(wei)了(le)(le)(le)加速療法的(de)發(fa)現，已經開發(fa)了(le)(le)(le)微流控(kong)器(qi)官芯片模(mo)型，以(yi)取(qu)代當前缺乏(fa)生物學(xue)相關性的(de)標準二維細(xi)胞(bao)(bao)培(pei)養模(mo)型，并(bing)減(jian)少動(dong)物實驗的(de)使用。這里介紹的(de)人類肺芯片（Lung organ Chip，下(xia)方均簡(jian)稱為(wei)“LoC”）模(mo)型是通過在上皮(pi)側或基底(di)側與動(dong)態流體一起(qi)共培(pei)養肺泡上皮(pi)細(xi)胞(bao)(bao)和血(xue)管內皮(pi)細(xi)胞(bao)(bao)形(xing)成的(de)，模(mo)擬(ni)了(le)(le)(le)人類肺泡的(de)結構和功能。為(wei)了(le)(le)(le)獲得更準確的(de)模(mo)型，從上皮(pi)側移除培(pei)養基，以(yi)創建氣液界面（Air-liquid interface，下(xia)方均簡(jian)稱為(wei)“ALI”）  。

這種肺芯片模型有(you)望更好地理解肺部(bu)疾(ji)病(bing)的發病(bing)機制(zhi)，并有(you)助(zhu)于開發更有(you)效的治療(liao)方法。

肺芯片構(gou)建過程

使用AKITA Plate-96芯片(pian)(pian)，并在每個芯片(pian)(pian)上進行(xing)24個單獨的實驗， 標準的96孔板格式適用于(yu)大(da)多數儀(yi)器(qi)（圖 a）。

圖a：AKITA Plate-96

人(ren)(ren)類(lei)肺癌(ai)上(shang)皮(pi)細胞（A549）在靜態側上(shang)培(pei)養，與(yu)動態微通道中(zhong)的人(ren)(ren)類(lei)臍(qi)靜脈內皮(pi)細胞（HUVEC）一起模擬肺微血管（圖 b）。

圖(tu)b：AKITA LoC模式圖(tu)

按(an)照(zhao)實驗計劃（圖 c），功能性(xing)屏(ping)障在培養了2天的(de)空氣液體界面下(xia)，于第7天形成(cheng)。使用右旋(xuan)糖酐(gan)（Dextran）來評(ping)估屏(ping)障的(de)滲(shen)透性(xing)。

圖c：AKITA LoC構建時(shi)間軸

結(jie)果(guo)1.  具有空氣-液體界面（ALI）的肺芯片（LoC）

在(zai) 70 kDa和(he)4 kDa右(you)旋(xuan)糖(tang)酐示蹤(zong)劑的(de)環境中，與上皮(pi)細胞單一培(pei)(pei)養與浸沒培(pei)(pei)養相比，有(you) ALI培(pei)(pei)養的(de)LoC裝置組的(de)差異較大（圖(tu)1，Mann-Whitney U檢驗，p＜0.05，N＝12）。對于(yu)共培(pei)(pei)養的(de)LoC，效果不太明(ming)顯，但(dan)所有(you)模型在(zai)更(geng)長(chang)的(de)培(pei)(pei)養時間(jian)內都能更(geng)好(hao)地維持(chi)低滲透性。

圖(tu)1  在浸沒和ALI環境下培養的LoC之(zhi)間(jian)的滲透性差(cha)異

該系統的光學特性允許使用(yong)共(gong)聚焦和掃描電子顯微鏡高質量地可視化細胞形態（圖2、3和4）。

圖2   在ALI下培養肺芯(xin)片4天后(hou)，上皮表面(mian)頂部的纖(xian)毛結構(掃描電子顯微(wei)鏡(jing))

圖3   經ALI培養6天后(hou)，從(cong)LoC上(shang)皮(pi)側的緊密連(lian)接(jie)表(biao)達的共聚焦圖像

圖4   經ALI培(pei)養6天后，使用共聚(ju)焦(jiao)顯微鏡對(dui)免疫(yi)染色的Lo裝置進行觀察

與(yu)靜態環(huan)境(jing)相比，動(dong)態流(liu)培養(yang)(yang)的LoC表現出(chu)更(geng)高的粘液表達。此外(wai)，在動(dong)態流(liu)條(tiao)件下培養(yang)(yang)的LoC中(zhong)，細胞定向和肌(ji)動(dong)蛋白結構更(geng)加明顯。

結果2.  動(dong)態(tai)流的影響

建立的LoC在第7天形成最(zui)緊密的屏障。與靜態環境(jing)相比，在動態流下培養的LoC的70kDa和4kDa右旋(xuan)糖(tang)酐分子的滲透性較大降低（圖5，Mann-Whitney U檢驗，p＜0.05，N＝18）。

圖5   位于氣液界面條(tiao)件下，靜態環境和動(dong)態流之間的(de)滲透性(xing)差異

結果3.  在肺(fei)泡肺(fei)芯片中模擬炎癥

使用AKITA的肺芯片，甚至可以檢(jian)測到10 ng/ml濃度的化(hua)合(he)物(wu)（如TNF-a和LPS脂多糖）對細胞毒性的影響（圖 6），可以測試化(hua)合(he)物(wu)以緩解組織炎癥(zheng)。

圖6  AKITA的肺芯片模擬炎癥反應(ying)

結論

總之，我們(men)建(jian)立(li)了(le)一個更(geng)高通量且功能(neng)性的(de)肺-芯片模(mo)型，采用(yong)(yong)氣(qi)液界面來(lai)復現肺上皮-內(nei)(nei)皮屏障(zhang)(zhang)。我們(men)展示(shi)了(le)微流(liu)體(ti)流(liu)動刺激在體(ti)外模(mo)型中的(de)重要性，并(bing)展示(shi)了(le)肺-芯片中緊(jin)密的(de)屏障(zhang)(zhang)、纖(xian)毛形(xing)成(cheng)以(yi)及粘液產生。已建(jian)立(li)的(de)肺-芯片模(mo)型緊(jin)密模(mo)擬了(le)體(ti)內(nei)(nei)的(de)肺泡結構(gou)，可用(yong)(yong)于臨床(chuang)前藥(yao)物(wu)發(fa)現、空氣(qi)污染物(wu)暴露以(yi)及其(qi)他藥(yao)理(li)學(xue)研究應用(yong)(yong)。

這一模型(xing)系統對于研究肺(fei)部疾病(bing)，如慢性肺(fei)阻(zu)塞(sai)（COPD）、新興(xing)病(bing)毒(du)感染、進(jin)行性纖維性肺(fei)疾病(bing)或原發(fa)性和轉移性肺(fei)癌等(deng)，將提供更好的系統。

關于AKITA

總部設在(zai)芬(fen)蘭，奧盧的(de)器官(guan)芯片(pian)制造商AKITA，by Finnfadvance，成立(li)于(yu)2019年。系統搭載擁有高通量(liang)器官(guan)芯片(pian)板，該板可(ke)被(bei)設計成單器官(guan)和多器官(guan)，兼(jian)容(rong)多種(zhong)成像模式，高人體(ti)相關性的(de)下一代人體(ti)體(ti)外模型，加速藥(yao)物開發，降低(di)臨床(chuang)前試驗失敗的(de)風險，也可(ke)用(yong)于(yu)個性化醫療。

上海曼博生物醫藥科技(ji)有限(xian)公司是AKITA，by Finnfadvance官(guan)方(fang)授(shou)權的(de)中國經銷商(shang)。

AKITA工(gong)作流程

下圖為主(zhu)要步驟的簡化工(gong)作(zuo)流(liu)程圖，且(qie)每種實驗都有特(te)定型號(hao)的詳細SOP。

AKITA Plate專(zhuan)為(wei)即插即用(yong)工作流程而設計，從(cong)而確保易用(yong)性、強(qiang)大的(de)數據收(shou)集(ji)和節省(sheng)時間。通過集(ji)成的(de)微(wei)孔膜(mo)將頂端(duan)和基(ji)底培養室(shi)分離(li)，該(gai)系(xi)統允許(xu)同時進行剪切流和靜態（共(gong)）培養。

因(yin)此，AKITA Plate能夠概括(kuo)多(duo)個人體器官(guan)的結構(gou)和功能復雜性，如屏障模型、氣液界面模型、微問題血管(guan)化等(deng)。

AKITA微(wei)流體板與(yu)標準的(de)96孔(kong)和384孔(kong)板格式(shi)一致，是高通(tong)(tong)量和易于操作的(de)共(gong)培養系統。此外，我(wo)們(men)的(de)AKITA Rocker 高通(tong)(tong)量精密搖床(chuang)有助于增強我(wo)們(men)肺道屏障模型的(de)人體相(xiang)關(guan)性(xing)、成熟度、緊密性(xing)等。

AKITA肺(fei)芯片系統

參考文獻

[1] Marshall DC, Salciccioli JD, Shea BS, et al. Trends in mortality from idiopathic pulmonary fibrosis in the European Union: an observational study of the WHO mortality database from 2001-2013. Eur Respir J 2018; 51:1701603. //doi.org/10.1183/13993003.01603-2017

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