心(xin)臟毒性體外(wai)(wai)模型：axoCells心(xin)室肌(ji)細胞(bao)對(dui)28種(zhong) CiPA 心(xin)臟毒性化合(he)物(wu)panel的(de)外(wai)(wai)部驗證

01- 心臟毒性背景

心(xin)(xin)臟(zang)毒(du)性(xing)(xing)是制藥(yao)行業(ye)中(zhong)藥(yao)物監管(guan)審批失敗的(de)(de)主(zhu)要原(yuan)因之一，使(shi)其成為藥(yao)物開發中(zhong)公認的(de)(de)挑(tiao)戰(zhan)。心(xin)(xin)臟(zang)安全藥(yao)理學面臨著(zhu)一些(xie)明確的(de)(de)挑(tiao)戰(zhan)，其中(zhong)Torsades de Pointes,TdP和其他致命性(xing)(xing)心(xin)(xin)律失常導致了(le)14個主(zhu)要藥(yao)物的(de)(de)撤市(shi)。為篩查這(zhe)些(xie)風(feng)險，使(shi)用(yong)了(le)多種心(xin)(xin)臟(zang)毒(du)性(xing)(xing)模型(xing)(xing)，包(bao)括體內（動物）模型(xing)(xing)、原(yuan)代細(xi)胞(bao)(bao)模型(xing)(xing)（直(zhi)接取自人或(huo)動物的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)），以(yi)及體外轉(zhuan)染了(le)離子通道的(de)(de)永生化細(xi)胞(bao)(bao)。盡管(guan)這(zhe)些(xie)模型(xing)(xing)提供(gong)了(le)一些(xie)價值，但(dan)“實驗室”與“臨床”之間仍存在轉(zhuan)化差距(ju)。

改進體外單(dan)離子通(tong)(tong)道(dao)模型的(de)(de)(de)方法可能是“多離子通(tong)(tong)道(dao)”模型，因為它(ta)們能更(geng)好(hao)地代表驅動(dong)(dong)(dong)人類心臟(zang)動(dong)(dong)(dong)作電位的(de)(de)(de)復(fu)(fu)雜離子通(tong)(tong)道(dao)活動(dong)(dong)(dong)（如下圖(tu)）。這些模型可以顯示出(chu)特征(zheng)性的(de)(de)(de)初(chu)始去極(ji)化，主(zhu)要(yao)由(you)于早期鈉通(tong)(tong)道(dao)，平/臺期則是由(you)鈣(gai)離子流(liu)入和鉀離子流(liu)出(chu)之間的(de)(de)(de)平衡形成(cheng)，快(kuai)速復(fu)(fu)極(ji)則由(you)鉀通(tong)(tong)道(dao)（主(zhu)要(yao)是hERG通(tong)(tong)道(dao)）驅動(dong)(dong)(dong)。hERG通(tong)(tong)道(dao)的(de)(de)(de)阻(zu)滯會導致動(dong)(dong)(dong)作電位持續時間（APD）延長和心律(lv)失常。重現這種相互作用對(dui)生理(li)相關模型很重要(yao)。

（圖片來源于網絡：//jingyan.baidu.com/article/4b52d702d8fc7dbd5d774b29.html）

這正是人類誘導性多能干細(xi)胞（iPSCs）展現巨大潛(qian)力的地方。iPSCs通過對人(ren)(ren)類(lei)供體(ti)(ti)材料進行重編程獲得，可(ke)以(yi)分化成心臟細胞，用(yong)于構建(jian)體(ti)(ti)外模型(xing)。由于這些細胞保留(liu)了(le)供體(ti)(ti)的特征（包括疾病(bing)突(tu)變、復雜的離(li)子通道活性和功能(neng)表現），它們能(neng)夠(gou)提供更具人(ren)(ren)類(lei)相關(guan)性的模型(xing)，用(yong)于研(yan)究(jiu)和心臟毒性篩(shai)查。

隨著FDA現代化法案2.0/3.0推動iPSC技術的更大量應用，Axol與健康與環境科學研究所（HESI）合作，并對axoCells iPSC衍生心室肌細胞(kit貨號：ax2508)進行了綜合體外致心律失常測試（CiPA）化合物panel的外部驗證，證明了axoCells iPSC衍生心室肌細胞（kit貨號：ax2508）在心臟毒性模型中的價值，是經CiPA驗證的商業可用的心肌細胞株。

關于CiPA - 綜合體外致心律失常試驗

綜合促心律失常檢測（CiPA）計劃是國際層面上，由多個監管機構（包括FDA、歐洲EMA、加拿大衛生部和日本NIHS）于2013年啟動的項目，旨在開發比hERG檢測和徹底QT研究更具specific藥物促心律失常潛力檢測方法，建立臨床前藥物心血管危險性評估的新體系和新標準 ，以更準確地預測臨床心律失常風險，提高臨床前藥物篩選的準確性和有效性，同時讓絕大多數新藥可以免于做 QT 人體臨床試驗，達到降低新藥研發費用的目的。

CiPA包括四個(ge)核心(xin)(xin)環節(jie)：（1）心(xin)(xin)臟多種離子通道評(ping)價（2）動作電位(wei)的計算機虛擬重建（3）iPSC誘導分化心(xin)(xin)肌細(xi)胞(bao)模(mo)型（4）臨床心(xin)(xin)電圖(tu)評(ping)估

結合人類心(xin)肌細胞、計算機技術和多通道系(xi)統，使TdP風(feng)險(xian)的(de)預測性(xing)得到改善(shan)，并已(yi)用(yong)于指導監管要求以評估心(xin)臟(zang)毒性(xing)風(feng)險(xian)。了解更(geng)多信(xin)息請訪(fang)問(wen)：

02- 實驗材(cai)料

Axol iPSC來源心肌細胞（貨號ax2508）被用于測(ce)試實驗。

主要特點：

· 解凍(dong)后3天(tian)自發跳動，7天(tian)即可(ke)進(jin)行檢測(ce)

· 經過所有28種(zhong)CiPA化合物的驗(yan)證

· 在ISO:9001認證的生產(chan)設(she)施中制造，嚴格質量控制

· 被世界范圍內前沿(yan)的生物制藥公司(si)和(he)學術機構用于研究和(he)心臟(zang)毒性測試

· 表型表征范圍較廣，包括形態學、免疫細胞化學和RNA測序，以評估其在基于iPSC的心臟毒性模型中的實用性。

圖中axoCells心(xin)室心(xin)肌細胞（貨號ax2508）細胞關(guan)鍵標志(zhi)物的(de)免疫細胞化學染色。展示了包括肌節對齊在內的(de)關(guan)鍵形(xing)態學特征。圖像1、2和4的(de)放大倍率為63倍；圖像3：40x。比例(li)尺= 20μm。

axoCells 心房心肌細(xi)胞試劑盒（貨號(hao)axo2500）

歡迎(ying)聯系(xi)上海曼博生物(wu)獲取報價

03- 實驗方法

CiPA化合物(wu)測試時，用到的(de)(de)axoCells iPSC衍(yan)生的(de)(de)心室心肌細胞（ax2508）被送往(wang)Clyde Biosciences進行(xing)外部評估，使(shi)用他們的(de)(de)CellOPTIQ系統來測量這些細胞對(dui)28種(zhong)CiPA化合物(wu)的(de)(de)反應。簡而言(yan)之(zhi)，細胞在培養(yang)6天后，使(shi)用無血清(qing)培養(yang)基和電(dian)壓敏感染料（VSD）進行(xing)孵育，并(bing)以(yi)四種(zhong)濃(nong)度處理(li)化合物(wu)（n=6）。對(dui)照(zhao)/陰性(xing)對(dui)照(zhao)為0.1% DMSO。陽性(xing)對(dui)照(zhao)為3nM的(de)(de)多非(fei)利特。

04- 結果(guo)

驗(yan)證數據顯示axoCells心室肌細胞（ax2508）對CiPApanel中(zhong)的(de)28種(zhong)(zhong)化合(he)物(wu)均有預期(qi)的(de)反應。每(mei)種(zhong)(zhong)化合(he)物(wu)在不同濃度下的(de)反應都被記錄，并評估是否有心律失常(chang)和靜(jing)息（在記錄圖(tu)上(shang)標記為Q）的(de)證據。所有(you)28種化合物的(de)數據可應(ying)要(yao)求提供，下(xia)方展示了(le)三種關鍵化合物的(de)結果(guo)。

4.1 試驗化合物：多非利特(TdP高風險)，是經典hERG通道阻滯劑，在0.3nM - 10nM濃度下處理心肌細胞。

結果顯示：多非利特(TdP高(gao)風險)處(chu)理，即使在minimun濃度下也表現出強(qiang)烈的(de)hERG阻滯，沒有早期去(qu)極(ji)化(hua)(EADs)，但高(gao)濃度的(de)細胞處(chu)于靜(jing)止(zhi)狀態。

4.2 測試(shi)化合物：拉諾(nuo)嗪（低TdP風(feng)險），濃度范圍為0.1μM到100μM，具有(you)多重(zhong)離(li)子(zi)(zi)通道(dao)效(xiao)應（早期(qi)Na+、晚期(qi)Na+和hERG離(li)子(zi)(zi)通道(dao)）。

結果顯示，在10μM濃度下，動(dong)作電位(wei)持續時間（APD）延長（hERG阻滯(zhi)）；在100μM濃度下，觀察到(dao)動(dong)作電位(wei)三角化，并且(qie)部(bu)分孔中出現了靜息狀態（早期Na+通道阻滯(zhi)）

4.3 試驗化合物：維(wei)拉帕米(低TdP風險)，鈣通道阻滯劑，0.001 μM - 1 μM處理心肌細胞(bao)。

結果顯示：在0.001 μM濃(nong)度下，動作電位(wei)持續時間(jian)（APD）延長(chang)且(qie)三角化增加（hERG阻滯）；在0.1 μM濃(nong)度下，APD縮短(duan)（L型Ca2+通道(dao)阻滯），表現出預期的藥物反應。

4.4 通過評估90%去極(ji)化時動作電位持(chi)續時間（APD90）的maximum變化、治療濃度下APD90的變化以及心律失常事件的證據。

（圖片為axoCells心室(shi)心肌細胞（ax2508）對所有28種CiPA化合物的總結數(shu)據）

結果顯示axoCells心室(shi)心肌(ji)細胞(bao)（ax2508）對所有28種CiPA化合物的反(fan)應(ying)程度與其致扭轉(zhuan)性室(shi)性心動(dong)過速（TdP）的風(feng)(feng)險成正比，即具有較(jiao)高TdP風(feng)(feng)險的藥物顯示出(chu)更大的動(dong)作電位持續(xu)時間變化或早期再極化及靜(jing)息事件。

05- 結論(lun)

1、為了(le)(le)(le)對axoCells心(xin)室心(xin)肌細胞(bao)進行(xing)體外(wai)心(xin)臟安全性(xing)篩(shai)查的獨立評估，尋求了(le)(le)(le)外(wai)部合作伙伴(ban)。將這些心(xin)肌細胞(bao)與(yu)28種已知有扭轉(zhuan)性(xing)室性(xing)心(xin)動過速(su)（TdP）風險的化合物進行(xing)了(le)(le)(le)測(ce)試，并在不(bu)同濃度(du)下與(yu)已知化合物的效果進行(xing)了(le)(le)(le)比(bi)較。

2、axoCells心(xin)室心(xin)肌細胞對所有28種(zhong)CiPA化合物(wu)表(biao)現出了(le)預(yu)期(qi)的藥理反應，從(cong)而驗證了(le)它們在心(xin)毒性篩查模型中的應用。

3、axoCells源自人(ren)誘(you)導多能干細(xi)(xi)胞(bao)（hiPSC）的(de)心(xin)室(shi)心(xin)肌(ji)細(xi)(xi)胞(bao)表達了多種關(guan)鍵離(li)子(zi)通(tong)道(dao)，并能夠(gou)對鈣通(tong)道(dao)阻滯(zhi)劑如硝(xiao)苯地(di)平和鈉通(tong)道(dao)阻滯(zhi)劑如特(te)非那定作出反(fan)應。特(te)別是，能觀察到動作電(dian)位(wei)持續時間的(de)延長，這是QT延長的(de)代(dai)表性指標，反(fan)映了對hERG通(tong)道(dao)阻滯(zhi)的(de)反(fan)應。

4、關鍵(jian)的(de)是，根據已知(zhi)化合物的(de)風(feng)險特征觀察到了分級響應。因此，axoCells心室心肌細(xi)胞(bao)可(ke)以用于篩查hERG通道阻滯(zhi)和相關的(de)TdP風(feng)險。

5、總之，axoCells心(xin)室心(xin)肌細胞(bao)適用于體(ti)外心(xin)臟安全性測(ce)試和(he)新化合物(wu)的心(xin)律失常(chang)風(feng)險檢測(ce)的人生(sheng)理相(xiang)關的體(ti)外模型。

axoCells關鍵優勢總(zong)結

· 大規模、質量(liang)和一致性

· 單獨為共培養而(er)設計

· 功能表現優(you)良

· 快速成(cheng)熟時間

· 符(fu)合(he)倫理(li)

關于(yu)英(ying)國Axol Bioscience

提供iPSC來源的神經元和心肌細胞

2013年成(cheng)(cheng)立(li)，總(zong)部位于(yu)英國劍橋。成(cheng)(cheng)立(li)以來一直聚焦(jiao)于(yu)iPSC領(ling)域技術產(chan)品的(de)開(kai)發制造和(he)服務，致力開(kai)發更好的(de)人(ren)類疾(ji)病模(mo)型。作為(wei)基于(yu) iPSC 的(de)神(shen)經科(ke)學、疼痛(tong)與感(gan)覺、心血(xue)管、眼科(ke)（AMD）、皮膚病等領(ling)域藥物發現和(he)篩選市(shi)場產(chan)品和(he)服務解決(jue)方案的(de)供應商，Axol Bioscience提(ti)供符合倫(lun)理、大規模(mo)質(zhi)量一致的(de)功能性iPSC衍(yan)生神(shen)經元(yuan)、心肌細(xi)胞(bao)和(he)皮脂(zhi)細(xi)胞(bao)等即用型細(xi)胞(bao)產(chan)品。

上海曼博生物是Axol Bioscience中國官方代理商。更多詳細資料/報價/CRO合作可聯系上海曼博生物。

參考文獻

1.Francis Grafton et al. (2021) Deep learning detects cardiotoxicity in a highcontent screen with induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes eLife 10:e68714 doi:

2.DiMasi JA, Grabowski HG, Hansen RW. Innovation in the pharmaceutical industry:New estimates of R&D costs. J Health Econ.2016 May;47:20-33. doi:

3.Blinova K et al. International Multisite Study of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes for Drug Proarrhythmic Potential Assessment. Cell Rep.2018 Sep 25;24(13):3582-3592. doi: //doi.org/10.1016/j.celrep.2018.08.079. PMID: 30257217; PMCID: PMC6226030.

4.Pognan, F., Beilmann, M., Boonen, H.C.M. et al. The evolving role of investigative toxicology in the pharmaceutical industry. Nat Rev Drug Discov 22, 317–335 (2023).//doi.org/10.1038/s41573-022-00633-x