連接腸道和肝臟：用于臨床前口服生物利用度剖析的人體相關性多器官微生理系統

亮點

美(mei)國(guo)知(zhi)名體外模(mo)型公(gong)司(si)Altis Biosystems利用CN-Bio的(de)(de)腸/肝多微生理(li)系統(tong)（Gut-Liver MPS）構建體外模(mo)型并(bing)開(kai)發(fa)(fa)了(le)一種(zhong)化學成(cheng)分(fen)限定、適應腸/肝共培養(yang)(yang)的(de)(de)培養(yang)(yang)基(ji)，成(cheng)功(gong)預測(ce)(ce)兩種(zhong)目前的(de)(de)模(mo)型無法(fa)充分(fen)預測(ce)(ce)人體ADME行為(wei)的(de)(de)藥物，并(bing)與文(wen)獻中已發(fa)(fa)表(biao)的(de)(de)人類和動物數據進(jin)行了(le)比較，突出了(le)Gut-Liver MPS 具有更高的(de)(de)人體相(xiang)關性生理(li)條件。

前(qian)言

吸收(Absorption)、分(fen)布(bu)(Distribution)、代(dai)謝(Metabolism)和(he)(he)(he)排泄(xie)(Excretion)，即ADME是(shi)(shi)指示藥(yao)(yao)(yao)物給藥(yao)(yao)(yao)后(hou)行為(wei)的(de)四個關鍵(jian)過程，在表征(zheng)化合物的(de)藥(yao)(yao)(yao)代(dai)動力學(xue)(xue)（PK）性質和(he)(he)(he)生物利用(yong)(yong)度(du)方(fang)面起關鍵(jian)作用(yong)(yong)。口服生物利用(yong)(yong)度(du)是(shi)(shi)指藥(yao)(yao)(yao)物在通過腸壁吸收和(he)(he)(he)肝(gan)臟首(shou)過代(dai)謝后(hou)到(dao)達全(quan)身(shen)循(xun)環的(de)比例。ADME和(he)(he)(he)生物利用(yong)(yong)度(du)在確定化合物的(de)安全(quan)性和(he)(he)(he)毒理學(xue)(xue)特征(zheng)方(fang)面至(zhi)關重要，因此是(shi)(shi)藥(yao)(yao)(yao)物開(kai)發前(qian)臨床階(jie)段的(de)重要測量指標。

目前(qian)使用(yong)一種簡單體(ti)外檢測方法(fa)(fa)來模(mo)擬腸道（如Caco-2細胞系）或肝臟（如肝微粒體(ti)和懸浮(fu)肝細胞），并結合體(ti)內動物(wu)模(mo)型來分析口(kou)服生物(wu)利用(yong)度。然而，這(zhe)兩(liang)種方法(fa)(fa)都存在較(jiao)大局限性：

• Caco-2細胞一(yi)直是評估體外腸道滲透性的主力(li)工具，但它(ta)們無法(fa)解(jie)釋肝(gan)臟代謝(xie)，且(qie)該細胞系的酶和轉運蛋白表達(da)水(shui)平缺失或較低

• 肝(gan)微粒體(ti)和(he)懸浮肝(gan)細胞(bao)用于體(ti)外(wai)藥(yao)物代(dai)謝篩選研究(jiu)，但它們不能顧(gu)及(ji)腸道吸收(shou)

總的來說，這些因素限制了其估算的準確性。此外，在一項對184種化合物的開創性研究中，發現動物模型與人類生物利用度的相關性較弱（R2 = 0.34）[1]。因此，需要一種新的、與人類更相關的方法，結合口服吸收和肝臟代謝，以更準確地估算藥物的生物利用度。

在過去的十年中，微生理系統（MPS），也稱為器官芯片（OOC），顯示出了提高ADME研究人類可翻譯性的潛力。它們通過灌注在 3D 支架上培養人類原代細胞，以更生理相關的方式再現細胞和組織的結構和功能生物標志物。為了改善藥物效力和安全性數據從體外到體內的轉化，出現了更復雜的MPS，其中之一是多個器官（如腸和肝）通過液流連接在一起，以模擬藥物吸收和首過代謝等過程[2]。

研(yan)究目(mu)標

在(zai)此，我(wo)們(men)引入了(le)一種雙(shuang)(shuang)器(qi)官微(wei)生理系統（MPS），該(gai)系統將我(wo)們(men)已經建立的(de)人類(lei)原代(dai)肝(gan)臟MPS與人類(lei)腸道的(de)原代(dai)模型連接在(zai)一起(qi)(qi)。對于腸道屏障，我(wo)們(men)從人類(lei)空腸中(zhong)分離(li)出原代(dai)細胞，并(bing)在(zai)仿生支架（RepliGut，Altis Biosystems）上進行擴增(zeng)。為了(le)將原代(dai)腸道和肝(gan)臟組織連接在(zai)一起(qi)(qi)，我(wo)們(men)開發(fa)了(le)一種化學(xue)成(cheng)分限定的(de)培養(yang)基，可以支持雙(shuang)(shuang)器(qi)官MPS中(zhong)的(de)這(zhe)(zhe)兩(liang)種器(qi)官模型。這(zhe)(zhe)種培養(yang)基能(neng)夠維(wei)持肝(gan)臟的(de)代(dai)謝功能(neng)和腸道屏障的(de)完整性。

通(tong)過使用已經深入(ru)研(yan)究(jiu)的(de)藥物(wu)化(hua)合(he)物(wu)，我們的(de)目(mu)標是展示(shi)這(zhe)種原代腸(chang)/肝MPS在分析口服藥物(wu)的(de)ADME行(xing)為(wei)方面相比于等效的(de)Caco-2腸(chang)/肝MPS，具有的(de)更(geng)高(gao)預測能力。

研究方(fang)法(fa)

請(qing)聯系上海曼(man)博生物獲取(qu)原英文資源。

結果與討論(lun)

01   使用(yong)PhysioMimix多(duo)(duo)器(qi)官系統及其多(duo)(duo)芯片雙器(qi)官板(ban)（圖1），我們建立了(le)一個原代腸/肝MPS，以克服當前模(mo)型在人類相關(guan)性(xing)方(fang)面的局限性(xing)，從而更好(hao)地分析口服藥物的生物利用(yong)度。

圖1. 在PhysioMimix雙器官(guan)板中(zhong)標準腸/肝MPS的設置

A) PhysioMimix多器(qi)官系統及其多芯(xin)片雙器(qi)官板(ban)(ban)的設置(zhi)，展示了板(ban)(ban)內腸道和肝臟隔(ge)室的位(wei)置(zhi)。每個(ge)板(ban)(ban)最(zui)多可以培養(yang)6個(ge)腸/肝模型(xing)。

B) 在Transwell插入物內的仿(fang)生(sheng)支架上培養的RepliGut模型示(shi)意圖(tu)，形成腸道上皮屏障(zhang)。

C) 雙器官板中肝臟(zang)隔室內流(liu)體流(liu)動(dong)的示意圖。

02   在RepliGut模(mo)型(xing)（圖2A）中(zhong)，空(kong)腸干細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)和祖細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)在仿生支(zhi)架上(shang)擴增(zeng)(zeng)至匯合，然后分化(hua)，導(dao)致屏障強度增(zeng)(zeng)加(jia)（圖2B）。基因表(biao)達(da)證實了(le)相(xiang)對于增(zeng)(zeng)殖期(qi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)，增(zeng)(zeng)殖細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)基因的(de)下調和分化(hua)腸細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)基因的(de)上(shang)調（圖2B）。在分化(hua)階(jie)段，RepliGut模(mo)型(xing)表(biao)達(da)了(le)組織(zhi)特(te)異性(xing)標志物(wu)，證實了(le)腸起源(yuan)以及緊密連接(jie)的(de)標志物(wu)和粘蛋白，確(que)認多(duo)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)譜系（圖2C）。通過組織(zhi)學觀(guan)察(cha)，分化(hua)后第(di)7天觀(guan)察(cha)到(dao)一層明確(que)且連續的(de)粘液層，證實了(le)這一點。相(xiang)比之下，在上(shang)皮細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)系Caco-2模(mo)型(xing)中(zhong)未(wei)觀(guan)察(cha)到(dao)粘液的(de)產生（圖2D）。為了(le)評估RepliGut模(mo)型(xing)在改善預測能力方面相(xiang)對于Caco-2模(mo)型(xing)的(de)潛(qian)力，我們研究(jiu)了(le)在藥(yao)物(wu)代謝和活性(xing)藥(yao)物(wu)轉(zhuan)運中(zhong)重要的(de)主要代謝酶和轉(zhuan)運蛋白基因的(de)表(biao)達(da)。與Caco-2細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)系相(xiang)比，基因表(biao)達(da)得到(dao)了(le)改善（圖2E）。

圖2. 與(yu)標準Caco-2細胞(bao)系模型相比，RepliGut原(yuan)代腸道模型更具人(ren)類相關性(xing)。

A) 從空腸樣本中分離出(chu)隱窩(wo)上皮干/祖細胞，并在(zai)靜態條(tiao)件下的仿生支架上擴增。

B) 在RepliGut模(mo)型的擴增(zeng)和(he)分化階段(duan)，通過TEER測量的屏障(zhang)完整性和(he)相對基因表達。

C) RepliGut模型的免疫熒光圖像。屏(ping)障染(ran)色(se)包(bao)括DAPI（深藍色(se)）、緊密連接蛋白ZO-1（淺藍色(se)）以(yi)及(ji)其他腸道標志(zhi)物如MUC2（黃色(se)）、微絨毛蛋白（紫(zi)色(se)）和CDX2（綠色(se)）。圖像比例尺為CDX2的100微米和其他三個(ge)標志(zhi)物的200微米。

D) RepliGut和Caco-2模型(xing)的(de)組織(zhi)學切片。單層橫截面用蘇木精和伊(yi)紅染色以可視化細(xi)胞核，并用阿爾新(xin)藍染色以可視化粘液層。

E) qPCR顯示(shi)RepliGut和(he)Caco-2模型(xing)中關鍵轉(zhuan)運(yun)蛋白(bai)和(he)代謝酶的相對基(ji)因表達。

03   兩個(ge)或多個(ge)組織(zhi)共(gong)同培養(yang)的(de)(de)一個(ge)挑戰是，建(jian)立能夠維(wei)持(chi)(chi)兩種(zhong)組織(zhi)類型功(gong)能的(de)(de)條件(jian)。我們設(she)計了一種(zhong)化學(xue)定義的(de)(de)培養(yang)基，添加(jia)到(dao)雙器(qi)官(guan)(guan)板的(de)(de)Transwell基底側(ce)和肝臟隔室中(zhong)（圖(tu)(tu)3A）。通(tong)過LDH釋(shi)放、CYP3A4活性(xing)(xing)和白(bai)蛋白(bai)生產進行(xing)測量發現，這(zhe)種(zhong)培養(yang)基在(zai)共(gong)培養(yang)中(zhong)至少48小(xiao)時(shi)內(nei)維(wei)持(chi)(chi)了肝細胞(bao)的(de)(de)健(jian)康(kang)和功(gong)能（圖(tu)(tu)3B-D）。在(zai)加(jia)入RepliGut模型到(dao)雙器(qi)官(guan)(guan)板后，通(tong)過TEER（圖(tu)(tu)3E）和Lucifer黃色通(tong)透性(xing)(xing)試驗（圖(tu)(tu)3F）進行(xing)測量發現，腸道屏(ping)障的(de)(de)完整性(xing)(xing)也在(zai)共(gong)培養(yang)的(de)(de)48小(xiao)時(shi)內(nei)得(de)以維(wei)持(chi)(chi)。

圖3. 在原代細(xi)胞腸(chang)/肝共培養中維持肝臟和腸(chang)道功能性標志物。

A) 建(jian)立原代(dai)RepliGut/肝(gan)MPS的(de)實(shi)驗時(shi)間線。RepliGut首先在(zai)靜態下獨(du)(du)立培養(yang)(yang)(yang)13天，然(ran)后在(zai)PHH播(bo)種后4天被轉移到PhysioMimix雙器(qi)官板的(de)Transwell隔室中(zhong)。共(gong)培養(yang)(yang)(yang)在(zai)化學(xue)定義的(de)培養(yang)(yang)(yang)基中(zhong)維持(chi)48小時(shi)。在(zai)共(gong)培養(yang)(yang)(yang)的(de)0、24和(he)48小時(shi)測量肝(gan)細胞健康(kang)和(he)功能性標(biao)志物，同(tong)時(shi)培養(yang)(yang)(yang)一個(ge)僅肝(gan)臟的(de)MPS作為對(dui)照(zhao)。我們研究了B) LDH釋放、C) CYP3A4活性和(he)D) 白(bai)蛋(dan)白(bai)生成。通(tong)過E) TEER和(he)F) Lucifer黃色的(de)通(tong)透性評估腸/肝(gan)MPS中(zhong)RepliGut的(de)屏障完整性，并與在(zai)標(biao)準RepliGut成熟培養(yang)(yang)(yang)基中(zhong)全程靜態培養(yang)(yang)(yang)的(de)獨(du)(du)立RepliGut進行比較。

04   功(gong)能性進一步(bu)通過(guo)7-羥基香(xiang)豆素（7-HC）給(gei)藥（圖4A）得以證明，7-HC，這是一種通過(guo)葡(pu)萄(tao)糖醛酸(suan)化進行(xing)II相代謝的(de)熒(ying)光化合物，以展示在共培養模型中(zhong)通過(guo)腸道屏障的(de)吸收及其后的(de)首過(guo)代謝。7-HC通過(guo)葡(pu)萄(tao)糖醛酸(suan)化進行(xing)代謝見圖4B，腸道和肝臟組織共同參與其清(qing)除見圖4C。

圖4. 首(shou)過(guo)代謝(xie)可(ke)以(yi)通(tong)過(guo)原代細(xi)胞腸/肝MPS進行模擬。

A) 腸/肝(gan)(gan)MPS模(mo)型中7-HC給(gei)藥的示(shi)意圖(tu)。1 mM的7-HC被加(jia)入(ru)到(dao)雙器官板的Transwell隔(ge)室(shi)(shi)(shi)(shi)的頂端(duan)，該(gai)隔(ge)室(shi)(shi)(shi)(shi)包含(han)RepliGut屏障(zhang)。隨后7-HC穿過屏障(zhang)進入(ru)在(zai)腸道(dao)和肝(gan)(gan)臟(zang)(zang)組織之間(jian)循環(huan)的培養基中。腸道(dao)對照組通(tong)(tong)過將(jiang)RepliGut模(mo)型插(cha)入(ru)雙器官板的Transwell隔(ge)室(shi)(shi)(shi)(shi)中（該(gai)隔(ge)室(shi)(shi)(shi)(shi)連接到(dao)一個空白的肝(gan)(gan)臟(zang)(zang)隔(ge)室(shi)(shi)(shi)(shi)，沒有PHH）進行準備。同樣，肝(gan)(gan)臟(zang)(zang)對照組通(tong)(tong)過將(jiang)7-HC加(jia)入(ru)到(dao)Transwell隔(ge)室(shi)(shi)(shi)(shi)中的一個空白Transwell插(cha)入(ru)物（沒有腸細胞(bao)）中進行準備。

B) 7-HC代謝的路徑(jing)。7-HC通過UGT酶進行II相(xiang)代謝，形成非熒(ying)光代謝產(chan)物7-羥基香豆素葡糖醛酸苷。

C) 隨時(shi)間變化的(de)循(xun)環(huan)培養(yang)基中7-HC濃度變化。

05   為了展示原代RepliGut/肝MPS相對于同等的Caco-2腸/肝MPS在預(yu)測能(neng)力上的改進(jin)，我們研究(jiu)了兩種藥物的ADME特性，這(zhe)兩種藥物在動(dong)物模(mo)型和Caco-2細胞系中均未能(neng)準(zhun)確(que)預(yu)測其在人類中的ADME行(xing)為和生物利用度。

一：替莫卡普利（Temocapril），是一種設計為抗腸道水解的前藥，通過羧酸酯酶1（CES1）代謝為替莫卡普利酸（Temopcarilat）（圖5A）。人類中的同工酶模式已被很好地表征，肝臟和腸道分別表達CES1和CES2[3]。在Caco-2細胞中，由于主要表達CES1，導致藥物清除率被高估（圖5B-C）。相反，RepliGut模型更符合人類的CES1和CES2表達比例，使其在前藥研究中更具相關性（圖5G）。替莫卡普利的清除率通過口服和靜脈給藥進行分析（圖5E）。靜脈給藥后24小時內肝臟迅速清除（圖5F）。與腸道CES表達一致，原代RepliGut/肝MPS正確報告了替莫卡普利對腸道水解的抵抗性，并且在口服給藥后48小時腸道頂端隔室中生成的替莫卡普利酸較少。

圖(tu)5. 案例研究1，替(ti)莫(mo)卡普(pu)(pu)利。替(ti)莫(mo)卡普(pu)(pu)利在原代細胞腸/肝MPS中對腸道清除的(de)抵抗性(xing)與人(ren)類腸道中的(de)同(tong)工酶表(biao)達相(xiang)關。

替莫卡(ka)普利被添(tian)加為(wei)口服劑量（100 μM）在(zai)Transwell的(de)頂端(duan)，或作為(wei)靜脈(mo)劑量（10 μM）直接混入肝臟隔室中的(de)循環培養基中。研究了兩(liang)種(zhong)腸/肝MPS配置：Caco-2/肝和RepliGut/肝。替莫卡(ka)普利：

A) 主要通(tong)過羧酸酯酶（CES）1同工(gong)酶代謝(xie)成活性代謝(xie)物替莫(mo)卡普利酸。

B) 人類肝臟、小腸和Caco-2細胞(bao)系中CES1同工酶的(de)RNA表達(da)和C) 蛋白質表達(da)模(mo)式。

D) 空腸模型中(zhong)CES基(ji)因在(zai)擴增(zeng)培養基(ji)（EM）和分化培養基(ji)（DM）中(zhong)的時間表達(da)模式；數據由UNC Chapel Hill的Scott Magness提供。

E) 在腸/肝模型中的(de)循環培養(yang)基(ji)中替莫(mo)卡普利濃度(du)隨時間變(bian)化，采用LC-MS測量。

F) 僅(jin)肝(gan)模型中的替(ti)莫卡普利濃(nong)度隨時間變化。

G) 各模型(xing)在(zai)48小(xiao)時內所有隔室(shi)中(zhong)(zhong)的(de)替(ti)莫(mo)卡普(pu)利總摩(mo)爾分數。H) 在(zai)藥物給(gei)藥后0和48小(xiao)時，在(zai)兩種腸/肝模型(xing)的(de)腸頂端隔室(shi)中(zhong)(zhong)替(ti)莫(mo)卡普(pu)利酸代謝(xie)物的(de)相對(dui)量(liang)。峰面積是(shi)化(hua)合物濃度的(de)定性測(ce)量(liang)。?

6   二：我們評估了兩種腸/肝MPS模型中咪達唑侖（Midazolam）的生物利用度，這是一種主要通過CYP3A4酶進行腸道清除的藥物[4]。咪達唑侖在靜脈給藥后迅速被肝臟清除，反映出其高內在肝臟清除率（19 mL/min/Kg）（圖6A）。與Caco-2腸/肝MPS相比，原代RepliGut/肝MPS對咪達唑侖的清除率更高（圖6B）。原代RepliGut/肝MPS還提供了一個更接近人類臨床觀察的口服生物利用度估計（圖6C）。

圖6. 案(an)例研究2，咪達唑侖。原代細胞腸/肝MPS與人類生物(wu)利(li)用度的改善(shan)相關性(xing)。

咪達(da)唑侖被(bei)添加為口服劑量（50 μM）在(zai)Transwell的頂端，在(zai)腸隔室內，或作(zuo)為靜脈劑量（5 μM）直接混(hun)入肝臟隔室中(zhong)的循環培(pei)養基(ji)中(zhong)。研究(jiu)了兩種腸/肝MPS配(pei)置：Caco-2/肝和RepliGut/肝。在(zai)48小時內取(qu)培(pei)養基(ji)樣本并通過LC-MS定(ding)量，以確定(ding)：

A) 在不同藥物(wu)處理方(fang)案后循環培(pei)養基中的咪達唑侖濃度和

B) 在各模型的所有隔室中48小時(shi)內剩余的咪達唑侖總摩(mo)爾分數。

C) 我們通(tong)過計算(suan)曲(qu)線下面積和劑量的(de)比率(lv)估算(suan)了兩(liang)種腸/肝MPS模型的(de)口服生物(wu)利(li)用度(du)，并與文(wen)獻(xian)中發表(biao)的(de)人類(lei)和動(dong)物(wu)數據進行了比較。

結論

這(zhe)(zhe)項研(yan)究(jiu)(jiu)表明，原(yuan)代(dai)(dai)RepliGut/肝(gan)(gan)(gan)MPS更準(zhun)確(que)地再現(xian)了(le)人(ren)體(ti)口服藥(yao)物(wu)給藥(yao)的(de)生理條(tiao)件。通(tong)過(guo)結合腸(chang)道(dao)吸收和(he)肝(gan)(gan)(gan)臟代(dai)(dai)謝，原(yuan)代(dai)(dai)RepliGut/肝(gan)(gan)(gan)MPS生成的(de)藥(yao)物(wu)濃度(du)(du)類(lei)(lei)似(si)于體(ti)內，無(wu)法(fa)用標準(zhun)的(de)臨床前(qian)體(ti)外模(mo)(mo)型(xing)復制。與Caco-2腸(chang)/肝(gan)(gan)(gan)MPS相比(bi)，原(yuan)代(dai)(dai)RepliGut/肝(gan)(gan)(gan)MPS在(zai)研(yan)究(jiu)(jiu)通(tong)過(guo)CES代(dai)(dai)謝的(de)前(qian)藥(yao)的(de)藥(yao)代(dai)(dai)動(dong)力學方(fang)面提供了(le)一種(zhong)更準(zhun)確(que)的(de)方(fang)法(fa)，而Caco-2腸(chang)/肝(gan)(gan)(gan)MPS未能準(zhun)確(que)描述這(zhe)(zhe)些藥(yao)物(wu)在(zai)人(ren)體(ti)中的(de)生物(wu)利用度(du)(du)。結果(guo)表明，原(yuan)代(dai)(dai)MPS模(mo)(mo)型(xing)提供了(le)一種(zhong)可行的(de)替代(dai)(dai)方(fang)法(fa)，可以克服Caco-2細胞(bao)系在(zai)這(zhe)(zhe)類(lei)(lei)藥(yao)物(wu)上的(de)人(ren)類(lei)(lei)相關(guan)性(xing)(xing)限制。通(tong)過(guo)在(zai)藥(yao)物(wu)發(fa)(fa)現(xian)的(de)早期階段生成更具人(ren)類(lei)(lei)相關(guan)性(xing)(xing)的(de)數(shu)據，可以在(zai)昂貴(gui)的(de)臨床前(qian)體(ti)內研(yan)究(jiu)(jiu)之前(qian)發(fa)(fa)現(xian)和(he)解決問題(ti)。

由于原(yuan)代(dai)(dai)RepliGut/肝MPS完全(quan)由原(yuan)代(dai)(dai)人類細胞組成(cheng)，不存(cun)在跨物(wu)(wu)種差異，因(yin)此該模型(xing)可(ke)用于幫(bang)助克服動物(wu)(wu)模型(xing)ADME預測與人類結果(guo)之間的(de)(de)低(di)相(xiang)關性。通過(guo)彌合(he)體外試驗和體內(nei)研究之間的(de)(de)差距，該模型(xing)使研究人員(yuan)能夠(gou)自信地推(tui)進(jin)最有前途的(de)(de)藥(yao)物(wu)(wu)候選(xuan)物(wu)(wu)，從(cong)而支(zhi)持降(jiang)低(di)成(cheng)本并(bing)減少所需的(de)(de)動物(wu)(wu)數(shu)量。

研究方(fang)法(fa)

在(zai)這(zhe)里，我們(men)描述了一種雙(shuang)(shuang)器(qi)官微生理系統（MPS），它將原(yuan)代(dai)(dai)人類腸(chang)道（RepliGut Planar-Jejunum，Altis Biosystems,一種商業化表達緊密連(lian)接(jie)蛋(dan)白的(de)極化腸(chang)上皮(pi)細胞單層(ceng)。可以實現(xian)生理比(bi)例的(de)所有主要(yao)細胞譜系）與原(yuan)代(dai)(dai)人類肝臟(zang)芯片（CN Bio）連(lian)接(jie)在(zai)一起。該雙(shuang)(shuang)器(qi)官MPS使用PhysioMimix多(duo)(duo)器(qi)官系統及(ji)其專用的(de)“多(duo)(duo)芯片”雙(shuang)(shuang)器(qi)官耗材板(ban)進行培養（圖1A）。雙(shuang)(shuang)器(qi)官板(ban)由六個孔(kong)組成，每(mei)個孔(kong)有兩個隔(ge)室(shi)：（i）Transwell隔(ge)室(shi)和（ii）肝臟(zang)隔(ge)室(shi)。可以獨(du)立(li)控制(zhi)每(mei)個隔(ge)室(shi)（腸(chang)道和肝臟(zang)）以及(ji)器(qi)官之間(jian)互連(lian)通道中的(de)流(liu)體流(liu)動（圖4A）。

通(tong)(tong)過(guo)(guo)在(zai)涂(tu)有(you)仿生(sheng)(sheng)支架(jia)的(de)(de)(de)(de)(de)Transwell上擴(kuo)增人(ren)類空腸干/祖細(xi)胞，并分(fen)化(hua)為由人(ren)類腸道(dao)中所有(you)終(zhong)末分(fen)化(hua)細(xi)胞組成的(de)(de)(de)(de)(de)極(ji)化(hua)屏(ping)障，建(jian)立了(le)腸道(dao)屏(ping)障。每48小時更(geng)換(huan)一次(ci)培養(yang)基(ji)，使(shi)用RepliGut生(sheng)(sheng)長或(huo)成熟培養(yang)基(ji)。通(tong)(tong)過(guo)(guo)每48小時進(jin)(jin)行(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)跨上皮(pi)電阻（TEER）測量(liang)或(huo)在(zai)雙(shuang)器(qi)官實驗(yan)結束時確定Lucifer黃色(se)(se)穿透Transwell的(de)(de)(de)(de)(de)通(tong)(tong)透性來評(ping)估腸道(dao)屏(ping)障的(de)(de)(de)(de)(de)完整性。通(tong)(tong)過(guo)(guo)熒(ying)光顯(xian)微鏡確認(ren)了(le)腸道(dao)起源標志物(wu)（Villin和(he)CDX2）和(he)緊(jin)密連接標志物(wu)ZO-1的(de)(de)(de)(de)(de)表達(da)(da)。通(tong)(tong)過(guo)(guo)阿爾(er)新藍染(ran)色(se)(se)RepliGut Planar-Jejunum橫截面(mian)以(yi)及在(zai)孔(kong)內對Muc-2蛋(dan)白進(jin)(jin)行(xing)免疫熒(ying)光染(ran)色(se)(se)，確認(ren)了(le)粘液的(de)(de)(de)(de)(de)產生(sheng)(sheng)。通(tong)(tong)過(guo)(guo)在(zai)Caco-2培養(yang)的(de)(de)(de)(de)(de)第(di)(di)15天或(huo)RepliGut Planar-Jejunum分(fen)化(hua)后的(de)(de)(de)(de)(de)第(di)(di)7天提取的(de)(de)(de)(de)(de)RNA，評(ping)估了(le)代謝和(he)轉(zhuan)運(yun)基(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)表達(da)(da)。代謝酶和(he)轉(zhuan)運(yun)蛋(dan)白的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因(yin)表達(da)(da)通(tong)(tong)過(guo)(guo)使(shi)用TaqMan基(ji)因(yin)表達(da)(da)檢測的(de)(de)(de)(de)(de)qPCR測量(liang)，并使(shi)用ΔΔCT分(fen)析確定相對表達(da)(da)。

對于肝(gan)(gan)(gan)臟(zang)，將原(yuan)代(dai)人類肝(gan)(gan)(gan)細胞（PHH）播種在(zai)(zai)(zai)(zai)PhysioMimix雙(shuang)器(qi)官板的(de)(de)(de)肝(gan)(gan)(gan)臟(zang)隔(ge)室中(zhong)，在(zai)(zai)(zai)(zai)多(duo)孔的(de)(de)(de)3D膠(jiao)原(yuan)蛋白涂層支(zhi)架上（圖(tu)1C）。在(zai)(zai)(zai)(zai)第4天(tian)(tian)(tian)，PHH播種和(he)(he)微組(zu)織形(xing)成(cheng)后(hou)(hou)，將分(fen)化的(de)(de)(de)RepliGut培養物添(tian)加到PhysioMimix雙(shuang)器(qi)官板中(zhong)，以建立(li)腸(chang)(chang)/肝(gan)(gan)(gan)共培養。使用化學(xue)定(ding)義(yi)的(de)(de)(de)培養基在(zai)(zai)(zai)(zai)至少48小時內維(wei)持(chi)腸(chang)(chang)和(he)(he)肝(gan)(gan)(gan)組(zu)織的(de)(de)(de)功能性(xing)，在(zai)(zai)(zai)(zai)此(ci)期間添(tian)加化合物以研究其ADME特性(xing)。在(zai)(zai)(zai)(zai)這項研究中(zhong)，我(wo)們比(bi)較(jiao)了原(yuan)代(dai)RepliGut/肝(gan)(gan)(gan)MPS與Caco-2腸(chang)(chang)/肝(gan)(gan)(gan)MPS的(de)(de)(de)性(xing)能。在(zai)(zai)(zai)(zai)第4天(tian)(tian)(tian)，PHH播種和(he)(he)微組(zu)織形(xing)成(cheng)后(hou)(hou)，通過添(tian)加帶有分(fen)化的(de)(de)(de)Caco-2單層細胞（播種后(hou)(hou)15-17天(tian)(tian)(tian)）的(de)(de)(de)Transwells到PhysioMimix雙(shuang)器(qi)官板中(zhong)，建立(li)了Caco-2腸(chang)(chang)/肝(gan)(gan)(gan)MPS。

我們在(zai)概念驗(yan)證研(yan)究(jiu)中(zhong)使用(yong)了7-羥基(ji)香豆素(su)（7-HC），這是一種通(tong)過(guo)葡萄糖(tang)醛(quan)酸化(hua)(hua)進(jin)行(xing)II相(xiang)代謝(xie)的(de)熒光化(hua)(hua)合(he)物(wu)(wu)，以展(zhan)示在(zai)共培養(yang)模(mo)型中(zhong)通(tong)過(guo)腸道屏障(zhang)的(de)吸收及(ji)其(qi)后的(de)首過(guo)代謝(xie)。PhysioMimix雙器官板允許在(zai)腸/肝(gan)共培養(yang)或僅腸（無PHH）和僅肝(gan)（無腸屏障(zhang)，化(hua)(hua)合(he)物(wu)(wu)加(jia)入到無細胞的(de)空Transwell中(zhong)）中(zhong)靈活地進(jin)行(xing)化(hua)(hua)合(he)物(wu)(wu)劑量研(yan)究(jiu)。在(zai)本(ben)研(yan)究(jiu)中(zhong)，研(yan)究(jiu)了兩種現有(you)模(mo)型無法預測其(qi)人類ADME特性(xing)的(de)化(hua)(hua)合(he)物(wu)(wu)（替莫普利和咪達(da)唑侖(lun)）。在(zai)PHH播種后的(de)第(di)4天和腸組織(zhi)添(tian)加(jia)到雙器官板后，通(tong)過(guo)口服(fu)（藥物(wu)(wu)添(tian)加(jia)到Transwell的(de)頂面）或靜脈注射（IV）（僅肝(gan)，藥物(wu)(wu)混入共培養(yang)基(ji)中(zhong)）給(gei)予(yu)化(hua)(hua)合(he)物(wu)(wu)。分(fen)別在(zai)0、1、4、6、24和48小時取樣，使用(yong)液相(xiang)色譜-質譜聯用(yong)（LC-MS）分(fen)析肝(gan)臟(zang)隔室(shi)中(zhong)母體(ti)化(hua)(hua)合(he)物(wu)(wu)的(de)濃度(du)。使用(yong)GraphPad Prism對(dui)口服(fu)和IV濃度(du)曲(qu)(qu)線(xian)的(de)曲(qu)(qu)線(xian)下(xia)面積（AUC）進(jin)行(xing)了估算。

參考(kao)文獻

1.Musther, H., Olivares-Morales, A., Hatley, O. J. D., Liu, B. & Hodjegan, A. R. Animal versus human oral drug bioavailability: Do they correlate? European Journal of Pharmaceutical Sciences 57, 280 (2014).

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