細胞(bao)(bao)外囊泡(pao)（EVs）攜(xie)帶著蛋(dan)白質(zhi)和(he)(he)核酸等生(sheng)物(wu)活(huo)性成分，能夠(gou)反映其母細胞(bao)(bao)的(de)(de)生(sheng)理狀態，并在介導(dao)復雜的(de)(de)細胞(bao)(bao)間信(xin)號傳遞中發揮重要作(zuo)用(yong)(yong)。利用(yong)(yong)這(zhe)些獨(du)特(te)的(de)(de)特(te)性，研究人員已經探索(suo)了其在細胞(bao)(bao)治(zhi)(zhi)療(liao)、非(fei)侵入性活(huo)組(zu)(zu)織(zhi)檢查和(he)(he)組(zu)(zu)織(zhi)再生(sheng)中的(de)(de)潛在應(ying)用(yong)(yong)。因此，標(biao)準化(hua)和(he)(he)可(ke)擴展(zhan)的(de)(de)EVs生(sheng)產與純化(hua)方法對于(yu)臨床應(ying)用(yong)(yong)和(he)(he)治(zhi)(zhi)療(liao)環境很重要。

圖為(wei)細(xi)胞外囊泡（EVs）生成與分泌的(de)途徑。來(lai)源(yuan)于文章：Chem Rev. 2018 Jan 31;118(4):1917–1950. doi: 10.1021/acs.chemrev.7b00534

傳統的(de)(de)生(sheng)(sheng)產(chan)(chan)(chan)和(he)(he)分(fen)(fen)離方(fang)法產(chan)(chan)(chan)量有限(xian)，制約了EVs的(de)(de)潛力。Huang等人近期的(de)(de)綜述中介紹了提高EVs生(sheng)(sheng)產(chan)(chan)(chan)的(de)(de)策(ce)略，主要(yao)包括(kuo)優(you)化(hua)細胞產(chan)(chan)(chan)量、擴大培養規(gui)模，以及(ji)(ji)探索(suo)非哺乳動物(wu)和(he)(he)人工合(he)成囊泡等替(ti)代生(sheng)(sheng)產(chan)(chan)(chan)來源，還闡述了通(tong)過調節(jie)培養參數、培養基成分(fen)(fen)及(ji)(ji)外部刺(ci)激來控制細胞培養，以提升(sheng)EVs的(de)(de)生(sheng)(sheng)產(chan)(chan)(chan)效率。其(qi)(qi)中生(sheng)(sheng)物(wu)反應器是 EVs 規(gui)模化(hua)生(sheng)(sheng)產(chan)(chan)(chan)的(de)(de)重要(yao)部分(fen)(fen)，VW垂直輪式生(sheng)(sheng)物(wu)反應器通(tong)過調控 3D 培養、剪切應力（如(ru) 20 dyn/cm2 促進 EVs 分(fen)(fen)泌）、pH 和(he)(he)氧濃度提升(sheng)產(chan)(chan)(chan)量，且其(qi)(qi)可(ke)擴展性（至 500 L）及(ji)(ji)模塊化(hua)控制（如(ru)溫度、營(ying)養供給(gei)）使其(qi)(qi)成為臨床轉化(hua)優(you)選方(fang)案。詳(xiang)細內容可(ke)參考原文：Huang et al. Emerging technologies towards extracellular vesicles large-scale production. Bioactive Materials 52 (2025) 338–365

以下簡(jian)要總結了幾篇不同來源細(xi)(xi)胞(bao)胞(bao)外(wai)囊(nang)泡（EVs）生(sheng)物(wu)制造(zao)研究，這些生(sheng)物(wu)制造(zao)的 EVs 展示出功能(neng)優(you)勢——促進體外(wai)和體內模型的恢復。這為神經病學及其他領域的無(wu)細(xi)(xi)胞(bao)療(liao)法(fa)開(kai)辟了令(ling)人興(xing)奮的可(ke)能(neng)性！

人類前腦類球體-EVs

對在垂直輪生(sheng)物反應器中生(sheng)物制造的(de)人(ren)前腦(nao)類球體（forebrain spheroids）衍生(sheng)細胞外囊泡（EVs）進行特征(zheng)分(fen)析

該研究探索了 Vertical-Wheel 生(sheng)(sheng)物反應(ying)(ying)器(qi)（VWBR）中(zhong)(zhong)(zhong)人類(lei)(lei)(lei)前腦類(lei)(lei)(lei)球體(ti)(ti)來源的(de)(de)細胞(bao)外(wai)囊泡（EVs）的(de)(de)規模(mo)化生(sheng)(sheng)產及其(qi)特(te)性(xing)。通(tong)過對比動態(tai)培(pei)養的(de)(de)iPSC衍(yan)生(sheng)(sheng)3D聚集體(ti)(ti)、使用Synthemax II微(wei)(wei)載體(ti)(ti)培(pei)養及靜態(tai)聚集體(ti)(ti)培(pei)養3種(zhong)條(tiao)件下產生(sheng)(sheng)的(de)(de)前腦類(lei)(lei)(lei)球體(ti)(ti)，發現微(wei)(wei)載體(ti)(ti)培(pei)養的(de)(de)前腦類(lei)(lei)(lei)球體(ti)(ti)生(sheng)(sheng)長速(su)率更(geng)高，其(qi) EVs 產量較(jiao)靜態(tai)聚集體(ti)(ti)提升(sheng)(sheng) 240–750 倍(bei)，動態(tai)聚集體(ti)(ti)次之(zhi)。EVs 尺(chi)寸在不同培(pei)養條(tiao)件下無明顯差異，但微(wei)(wei)載體(ti)(ti)和(he)動態(tai)聚集體(ti)(ti)來源的(de)(de) EVs 富含促進(jin)軸突引導(dao)、抗凋亡、清除活性(xing)氧及調節免(mian)疫反應(ying)(ying)的(de)(de)蛋白質與 miRNA（如 miR-302a、miR-21）。功能(neng)實(shi)驗表明，這些 EVs 可(ke)調節氧糖剝奪模(mo)型(xing)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)細胞(bao)代謝(xie)(xie)，降低凋亡水平(ping)，并在體(ti)(ti)外(wai)中(zhong)(zhong)(zhong)風模(mo)型(xing)中(zhong)(zhong)(zhong)促進(jin)神(shen)經(jing)恢復。研究證(zheng)實(shi)，VWBR 的(de)(de)動態(tai)微(wei)(wei)環境通(tong)過調節細胞(bao)代謝(xie)(xie)和(he) EVs 生(sheng)(sheng)物發生(sheng)(sheng)基(ji)因表達，明顯提升(sheng)(sheng) EVs 產量與治療(liao)相關(guan) cargo 含量，為缺血性(xing)中(zhong)(zhong)(zhong)風等神(shen)經(jing)系統(tong)疾病的(de)(de) EVs 療(liao)法提供了可(ke)規模(mo)化的(de)(de)生(sheng)(sheng)物制造(zao)系統(tong)。

圖為該篇文章人(ren)類誘導(dao)多能干細(xi)胞（iPSC）接種方(fang)案示意圖、分化時(shi)間表和實驗(yan)設計(ji)示意圖。Agg，指在(zai)VWBR中(zhong)培(pei)養(yang)的(de)聚集(ji)體；MC，指在(zai)VWBR中(zhong)附著在(zai)Matrigel涂層(ceng)微載體上的(de)細(xi)胞；6-well，指在(zai)6孔板中(zhong)作為靜態培(pei)養(yang)的(de)聚集(ji)體。

詳細內(nei)容參考原(yuan)文章：Liu et al. Profiling biomanufactured extracellular vesicles of human forebrain spheroids in a Vertical-Wheel Bioreactor. J of Extracellular Bio. 2024;3:e70002.

iPSC-EVs

在垂直輪式生物反(fan)應器中3D培養人類多(duo)能干細胞生成(cheng)細胞外(wai)囊泡（EVs）

文中(zhong)利用(yong)新型 Vertical-Wheel 生物反(fan)應(ying)器（VWBR）規模(mo)化生產(chan)人誘(you)導(dao)多(duo)能干(gan)細胞(bao)（hiPSC）分(fen)泌的(de)細胞(bao)外囊泡（EVs）。研究在(zai) VWBR 中(zhong)對比了(le) hiPSC 的(de)三維聚集體(ti)與微載體(ti)培養模(mo)式，并(bing)用(yong) mTeSR 和(he) HBM 培養基培養后收集 EVs。

圖(tu)為垂(chui)直輪生(sheng)物(wu)反應器中誘導(dao)多(duo)能干細胞(bao)3D擴增的示意圖(tu)，含不(bu)同培(pei)養條件的設置

結(jie)(jie)果顯(xian)示(shi)，微載(zai)體(ti)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)的(de) EVs 產量較(jiao)聚集體(ti)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)高(gao) 17-222 倍(bei)，且 mTeSR 培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基可(ke)使 EVs 產量提(ti)升 2.7-3.7 倍(bei)，所獲 EVs 尺(chi)寸更小(xiao)（約(yue) 115.7 nm），富含抗(kang)凋亡(wang)蛋白及 Wnt 通路相(xiang)關(guan) miRNA（如 miR-302、miR-21）。同時(shi)，結(jie)(jie)果表明(ming)幾個EVs生(sheng)(sheng)成相(xiang)關(guan)基因受培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)條件的(de)影響(xiang)，而(er)在mTeSR培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基中使用微載(zai)體(ti)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)可(ke)能是對(dui)EVs生(sheng)(sheng)成刺激較(jiao)強(qiang)的(de)條件。功能實(shi)驗表明(ming)，該(gai) EVs 可(ke)促(cu)進小(xiao)膠質細(xi)(xi)胞增殖并誘導其向抗(kang)炎 M2 型極化(hua)。此研究建立(li)了(le)(le)可(ke)靠有效的(de)hiPSC-EVs 生(sheng)(sheng)產platform，其低(di)剪切力培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)體(ti)系適用于規模化(hua)生(sheng)(sheng)產，EVs 成分在神經保護、抗(kang)衰老及免疫調節中具潛在價值，為中風(feng)、阿爾茨海(hai)默病等疾病的(de)細(xi)(xi)胞外囊泡療(liao)法轉(zhuan)化(hua)提(ti)供(gong)了(le)(le)實(shi)驗基礎。詳細(xi)(xi)數據(ju)可(ke)查看(kan)原文章：Muok et al. Extracellular vesicle biogenesis of three-dimensional human pluripotent stem cells in a novel Vertical-Wheel bioreactor. J of Extracellular Bio. 2024;3:e133.

hMSC-EVs

在垂直輪(lun)式生物反應器中擴大MSCs生產，提(ti)高了(le)細胞外囊(nang)泡的分泌(mi)和(he)cargo譜(pu)

這篇(pian)2023年的(de)(de)研究探索(suo)了新型 Vertical-Wheel 生物(wu)反(fan)應器(qi)（VWBR）規模(mo)化培養人間(jian)充(chong)質基質細胞（hMSCs）對細胞外(wai)囊泡（EVs）分泌及(ji)成分的(de)(de)影響。在 0.1L 和 0.5L 反(fan)應器(qi)中，hMSCs 通過微載體培養于(yu)(yu) 25–64 RPM（0.1–0.3 dyn/cm2 剪切應力），相(xiang)比 2D 培養，EVs 分泌量提升(sheng) 2.5 倍，且(qie) EVs 中 miR-10、19a、21、132 等促血管生成和神經保(bao)護相(xiang)關 miRNA 明(ming)顯上調(diao)。蛋白(bai)(bai)質組(zu)學(xue)顯示(shi)，EVs 富(fu)含代(dai)謝、自噬及(ji) ROS 調(diao)控(kong)蛋白(bai)(bai)，與 2D 培養組(zu)相(xiang)比差異(yi)明(ming)顯。0.5L 反(fan)應器(qi)驗證了系統可(ke)擴展性，EVs 促進(jin)人成纖維細胞傷口愈合能(neng)力優(you)于(yu)(yu) 2D 組(zu)。研究表明(ming)，VWBR 通過調(diao)控(kong) hMSCs 糖酵(jiao)解、自噬及(ji) ROS 通路，增強 EVs 分泌并重(zhong)塑其 cargo 譜，為缺(que)血性卒中、阿爾茨海(hai)默病等神經疾病的(de)(de) EVs 療法提供了可(ke)規模(mo)化生產的(de)(de)生物(wu)制造platform。詳細數(shu)據可(ke)查看(kan)原文章：Jeske et al. Upscaling human mesenchymal stromal cell production in a novel vertical-wheel bioreactor enhances extracellular vesicle secretion and cargo profile. Bioactive Materials 25 (2023) 732–747

在上述(shu)研究中(zhong)對富集(ji)的(de)(de)EVs終產品的(de)(de)質量(liang)(liang)要求越嚴格，也就意(yi)味(wei)著對培養基(ji)的(de)(de)質量(liang)(liang)要求更加(jia)嚴格，EVs培養基(ji)的(de)(de)選擇(ze)需綜(zong)合考量(liang)(liang)EVs產量(liang)(liang)及下游純化(hua)工藝(yi)的(de)(de)復雜性，化(hua)學成分限(xian)(xian)定(ding)(Chemically Defined)的(de)(de)培養基(ji)是EVs工藝(yi)研究中(zhong)的(de)(de)優選方案。日(ri)本Solallis制造的(de)(de)Stem Design系列(lie)化(hua)學成分限(xian)(xian)定(ding)的(de)(de)MSC擴增培養基(ji)(MSC Culture Medium AF)和EVs培養基(ji)(EVs Collection Medium)已經在EVs生產工藝(yi)中(zhong)取得成功，且同時兼容2D、3D培養體系。

Stem Design系列培養基具有(you)以下(xia)特征：

?? 化學(xue)成分限定（Chemically Defined）

?? 無動(dong)物源性（Animal Origin Free）

?? 不含細胞外囊泡（EVs Free）

?? 即(ji)用型完全培養基，無需額外添加補充劑

?? 成分、濃度準確(que)可控，批次一致性良好

?? 與血清(qing)/血清(qing)替代(dai)物培養體系相當的培養效果

想了解更多關于(yu)Stem Design系列培養基的信(xin)息，歡迎聯系上海曼博(bo)生物！

掃描下方二維碼，申請培養基試(shi)用

NK 細胞- EVs 的聯合抗癌應用

白介素-15刺激的自然殺傷細(xi)胞(bao)來源細(xi)胞(bao)外囊(nang)泡與卡(ka)鉑在H1975肺癌細(xi)胞(bao)中(zhong)的聯(lian)合作用

本研究探究了白細(xi)胞介(jie)素-15（IL-15）刺(ci)激(ji)的自然殺傷細(xi)胞（NK）衍生細(xi)胞外囊(nang)泡（NK-EVs）與卡鉑（CBP）聯合用于奧(ao)希替尼(ni)耐藥的 H1975 肺癌細(xi)胞的治療效果(guo)。

NK92細(xi)(xi)胞(bao)使用含12.5%馬血清、12.5%胎牛血清（FBS）和5%新鮮氫化可的松(song)的MyeloCult H5100培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)至第4代。在(zai)含5% CO2的培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)箱中(zhong)，每周更換(huan)(huan)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)兩次(ci)。當細(xi)(xi)胞(bao)匯合(he)度(du)達到80-90%時，收(shou)獲單細(xi)(xi)胞(bao)懸液，并在(zai)PBS 0.5L垂直輪生物反(fan)應器(qi)中(zhong)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)。接種前(qian)一天，細(xi)(xi)胞(bao)在(zai)去(qu)除外泌體的培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)中(zhong)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)。反(fan)應器(qi)中(zhong)細(xi)(xi)胞(bao)濃度(du)設為20,000個細(xi)(xi)胞(bao)/mL，攪(jiao)(jiao)拌速度(du)為25 rpm，采用12個周期交替靜態（15分鐘）與攪(jiao)(jiao)拌（5分鐘），總時長為4小時。培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)中(zhong)加入細(xi)(xi)胞(bao)因子IL-15（25 ng/mL），以增(zeng)強NK細(xi)(xi)胞(bao)的細(xi)(xi)胞(bao)毒活性。每四天從生物反(fan)應器(qi)采集0.5 mL培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)，并以25 rpm攪(jiao)(jiao)拌，目的是(shi)監測NK92細(xi)(xi)胞(bao)的代謝情況并確定(ding)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)的更換(huan)(huan)時間。使用BioProfile Flex2分析(xi)儀評估培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)的乳酸和葡(pu)萄糖濃度(du)。根據(ju)代謝結果，每四天更換(huan)(huan)40%的培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)，兩周后收(shou)集培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)。

通(tong)過(guo)垂直輪生物反應器培養NK細胞，分(fen)(fen)離的NK-EVs 經納(na)米顆(ke)粒跟蹤分(fen)(fen)析、原子力(li)顯(xian)微鏡(jing)和蛋(dan)白(bai)質組學表(biao)(biao)征(zheng)，顯(xian)示其具有典型外泌體(ti)特征(zheng)，富(fu)含穿孔素、顆(ke)粒酶 B 等細胞毒性蛋(dan)白(bai)。體(ti)外實(shi)驗(yan)表(biao)(biao)明(ming)(ming)，NK-EVs 與 CBP 聯(lian)(lian)合可(ke)降低(di) CBP 的半數抑(yi)制濃度（IC??），明(ming)(ming)顯(xian)抑(yi)制 2D 和 3D 培養的腫瘤細胞活力(li)，誘導細胞周期(qi)阻滯和凋亡。體(ti)內荷瘤小(xiao)鼠實(shi)驗(yan)顯(xian)示，聯(lian)(lian)合治療明(ming)(ming)顯(xian)縮小(xiao)腫瘤體(ti)積(ji)，機(ji)制上(shang)通(tong)過(guo)下調(diao) PD-L1/PD-1 免疫檢查點，抑(yi)制 SOD2、PARP、BCL2 等抗(kang)凋亡蛋(dan)白(bai)，激活抗(kang)炎通(tong)路。該研究首次證實(shi) NK-EVs 與 CBP 聯(lian)(lian)合在耐藥肺癌中的協同作用(yong)，為免疫化療聯(lian)(lian)合策略提(ti)供了新方向。

詳細(xi)內容和數據可查看(kan)原文章：Nathani et al. Combined Role of Interleukin-15 Stimulated Natural Killer Cell-Derived Extracellular Vesicles and Carboplatin in Osimertinib-Resistant H1975 Lung Cancer Cells with EGFR Mutations. Pharmaceutics 2024,16,83.  

文中用到的垂直輪生物反應器，就是下面這款來自PBS Biotech的Vertical Wheel垂直輪式生物反應器。總結下反應器特點如下：

?? 3D懸浮(fu)培養

?? 獨特垂直輪技(ji)術

?? 低剪(jian)切力、溫和均勻的(de)水流動(dong)力學環(huan)境

?? 0.1L-80L多(duo)種規格，滿足不同階段(duan)需求，且具(ju)優異放大(da)性(xing)

?? 研究級/GMP版(ban)本可選

?? 灌流(liu)版本可選

?? PBS反應器適用的3D懸(xuan)浮培養場景（包含但不(bu)限于）：

        ?  iPSC擴(kuo)增(zeng)（aggregates或(huo)MC）

        ?  iPSC及下游分化（胰島、神經(jing)、免疫細(xi)胞等(deng)）

        ?  iPSC-T/ 原代CAR-T

        ?  iPSC-NK /原(yuan)代NK

        ?  iPSC-MSC/原代MSC

        ?  胞(bao)外囊泡（EVs）生物制造，如前(qian)腦類(lei)球體、MSC、NK、MSC等來源EVs的研究及臨床(chuang)轉化 

        ?  類(lei)器官(guan)懸(xuan)浮培養(yang)或(huo)分化等

如果您對該反應器(qi)感興趣，歡迎聯系曼(man)博生(sheng)物技(ji)術(shu)，或掃碼預約demo測試！