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英國Nuclera公司的(de)eProtein Discovery是一個無細(xi)胞蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)合成（CFPS）系(xi)統(tong)，也被稱作體(ti)外轉錄/翻譯系(xi)統(tong)，能(neng)夠實現蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)的(de)快(kuai)速原型設計。該(gai)系(xi)統(tong)采用數(shu)字(zi)微流控(kong)芯(xin)片和定制試劑，可針對(dui)多(duo)(duo)達192種(zhong)條件(jian)篩(shai)選(xuan)(xuan)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)表(biao)(biao)達與可溶性(xing)，包括在(zai)(zai)8種(zhong)無細(xi)胞表(biao)(biao)達條件(jian)下對(dui)至(zhi)多(duo)(duo)24種(zhong)構建體(ti)的(de)篩(shai)選(xuan)(xuan)。可在(zai)(zai)48小(xiao)時內(nei)完成從DNA到(dao)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)篩(shai)選(xuan)(xuan)與放大(da)生產。

使用(yong)eProtein Discovery系統快速無(wu)細胞表達和純化(hua)B淋(lin)巴細胞抗原(yuan)CD19

一、引言

B 淋(lin)巴細(xi)(xi)胞(bao)抗原CD19是一(yi)種跨膜糖蛋白(bai)，為B細(xi)(xi)胞(bao)惡性(xing)腫瘤生物標志(zhi)物、CAR - T等療(liao)法理想靶點，包含單(dan)個(ge)跨膜螺旋（292-313）、天然信號肽(tai)（1-20）、胞(bao)外N端結(jie)(jie)構(gou)域(yu)(yu)（ECD）和胞(bao)內(nei)C端結(jie)(jie)構(gou)域(yu)(yu)（ICD）。其ECD有兩個(ge)通過二硫鍵連接的免(mian)疫球蛋白(bai)樣C2型結(jie)(jie)構(gou)域(yu)(yu)，ICD有多個(ge)無序(xu)區(qu)域(yu)(yu)。生產CD19，尤其是ECD對(dui)開發新的B細(xi)(xi)胞(bao)淋(lin)巴瘤治療(liao)方法十分重(zhong)要。然而，ECD素來有“難表(biao)達(da)”的特點，會(hui)導致表(biao)達(da)滴度低、蛋白(bai)質錯誤折(zhe)疊和聚集，阻礙了(le)對(dui)細(xi)(xi)胞(bao)表(biao)面分子的詳(xiang)細(xi)(xi)分子研究。

在本應用中，我們利用eProtein Discovery系統(tong)的可溶性標簽選(xuan)擇(ze)功能和無(wu)細胞混合(he)物，在24小時內篩(shai)選(xuan)了(le)192種(zhong)表(biao)(biao)(biao)達條件，優(you)化了(le)可溶性CD19蛋(dan)白的生(sheng)產(chan)（如圖1所示(shi)）。我們成功表(biao)(biao)(biao)達并(bing)純化了(le)全長CD19、ECD和ICD。篩(shai)選(xuan)完成后，在24小時內將適(shi)合(he)條件進(jin)行放大，可生(sheng)產(chan)微克級(ji)的蛋(dan)白質(zhi)，從而實現(xian)了(le)治療研究所需復雜蛋(dan)白質(zhi)的提效生(sheng)產(chan)。本應用為表(biao)(biao)(biao)達其(qi)他具(ju)有(you)跨(kua)膜結(jie)構(gou)域(yu)(yu)、二硫鍵和高度無(wu)序區域(yu)(yu)的“難(nan)表(biao)(biao)(biao)達”蛋(dan)白質(zhi)提供了(le)參考(kao)。

二、eProtein Discovery工作流程

eProtein Discovery系統利用無(wu)細胞蛋白質合成技術，可快速(su)篩選蛋白質構建體并(bing)放大生產復雜蛋白質（圖1）。

圖1. eProtein Discovery工作流程。從DNA到可(ke)溶性(xing)蛋白只需(xu)48小(xiao)時。

在本研究中(zhong)，選(xuan)擇了(le)三種(zhong)CD19長度(du)變體(ti)(ti)(ti)：全長CD19（CD19_21-556）、N端截短體(ti)(ti)(ti)（CD19_21-277）和(he)C端截短體(ti)(ti)(ti)（CD19_327-556）。這兩種(zhong)截短體(ti)(ti)(ti)均去除了(le)CD19的跨膜區域。此外(wai)，全長和(he)N端截短體(ti)(ti)(ti)均省略(lve)了(le)初始信(xin)號肽序列（0-20）。這些(xie)變體(ti)(ti)(ti)被輸入eProtein Discovery軟件并進行(xing)密碼子(zi)優化，隨(sui)后添(tian)加3C和(he)TEV側翼(yi)序列。使用可(ke)溶(rong)(rong)性篩選(xuan)構建(jian)體(ti)(ti)(ti)試劑盒生成包含不同(tong)可(ke)溶(rong)(rong)性標(biao)簽(qian)的表達(da)構建(jian)體(ti)(ti)(ti)，以及一個不含可(ke)溶(rong)(rong)性標(biao)簽(qian)的構建(jian)體(ti)(ti)(ti)。每個構建(jian)體(ti)(ti)(ti)的C端均整(zheng)合了(le)用于磁(ci)珠(zhu)純化的Strep標(biao)簽(qian)和(he)用于表達(da)純化后蛋白質定(ding)量的檢測標(biao)簽(qian)（圖(tu)2A）。

圖(tu)2. 實驗篩選條(tiao)件。（A）為三種CD19長度變體生成(cheng)的(de)帶有可溶性標簽的(de) eGene 構(gou)建體。

在制(zhi)備(bei)eGene構建體后，向8種(zhong)包含(han)無細胞核(he)心試劑(ji)的無細胞混(hun)合物中添加各(ge)種(zhong)添加劑(ji)，包括分子伴(ban)侶（DnaK）、二硫鍵促進劑(ji)（PDI+/GSSG）和可溶性標簽切割(ge)酶（3C蛋白酶）（圖(tu)2B）。

圖2. 實驗篩選條件。（B）用于提高可溶(rong)性蛋白產(chan)量的無細(xi)胞混合物選擇。

將(jiang)24種(zhong)eGene構建體和(he)8種(zhong)無細胞(bao)混(hun)(hun)合物與純化(hua)磁珠、對照/空白(bai)樣品和(he)緩沖液一起加樣到卡盒上。這種(zhong)利用eProtein Discovery系統的設(she)置(zhi)，促進(jin)了192種(zhong)表達(da)譜(pu)的自動生成和(he)分(fen)析。每種(zhong)CD19變體表達(da)最高的10種(zhong)eGene/無細胞(bao)混(hun)(hun)合物組合會被自動選(xuan)擇用于純化(hua)，并完成蛋白(bai)質檢測(ce)以(yi)確定預(yu)測(ce)的放大產量(liang)，所有這些都在(zai)24小時內完成。

對于每種(zhong)CD19變(bian)體，將預測產量(liang)至高的表達(da)方(fang)案第二天進行放大(da)生產，并使用放大(da)試劑盒(he)進行純化，以生產微克(ke)級的蛋白質(zhi)。蛋白質(zhi)純度和(he)產量(liang)通過SDS-PAGE和(he)熒光(guang)測定(ding)法進行定(ding)量(liang)分(fen)析。

三、結果

eProtein Discovery系統成功(gong)表達并純化了全(quan)長CD19蛋(dan)白及其截(jie)短變(bian)體，證明了其強大(da)的性能（見圖 3）。該系統用于快速篩選192種表達條(tiao)件，并在24小時內(nei)獲得30個(ge)可純化性數據點，以確(que)定生(sheng)產可溶性CD19蛋(dan)白變(bian)體的最佳條(tiao)件（圖 3A 和 3B）。

圖3. 篩選結果(guo)。（A）每種(zhong)eGene構建體(ti)與(yu)無細胞混合物(wu)組合的表達產(chan)量。

圖3. 篩選結果(guo)。（B）每(mei)種CD19長度(du)變體表(biao)達量至高(gao)的 10 種組合經(jing)純(chun)化后確定純(chun)化濃度(du)。

在三(san)種CD19變體中，N端胞外(wai)結構域(yu)（CD19_21-277）的(de)蛋白產量(liang)更高，預測產量(liang)達29.68 μg/200 μL（圖 3C）。

圖3. 篩選結果。（C）200μL放大體系的(de)預測產量。

引入可(ke)(ke)溶(rong)性標簽(qian)（尤其FH8標簽(qian)）使(shi)CD19總產(chan)量(liang)顯著提升32% ；無(wu)細胞混(hun)(hun)合(he)物(wu)中添加PDI+/GSSG可(ke)(ke)促進二(er)硫(liu)鍵形(xing)成，提升ECD表(biao)(biao)達量(liang)，混(hun)(hun)合(he)物(wu)4與FH8標簽(qian)聯用預(yu)測產(chan)量(liang)更高，混(hun)(hun)合(he)物(wu)3則(ze)兼具高產(chan)量(liang)與標簽(qian)切除(chu)靈活性。該(gai)系統成功篩選出(chu)生(sheng)產(chan)可(ke)(ke)溶(rong)性全長(chang)CD19的(de)條件(jian)，產(chan)量(liang)4.29 μg/200 μL，混(hun)(hun)合(he)物(wu)3表(biao)(biao)現優，體現優化(hua)蛋(dan)白(bai)生(sheng)產(chan)的(de)多功能(neng)性與精準性，不過全長(chang)CD19產(chan)量(liang)仍需優化(hua)。無(wu)細胞系統有效降(jiang)(jiang)低了天然系統中無(wu)序(xu)蛋(dan)白(bai)常見的(de)蛋(dan)白(bai)酶降(jiang)(jiang)解風險，同時(shi)通過可(ke)(ke)溶(rong)性標簽(qian)和添加劑的(de)使(shi)用減(jian)少(shao)不溶(rong)性聚集物(wu)的(de)產(chan)生(sheng)。這一能(neng)力使(shi)得該(gai)挑戰性蛋(dan)白(bai)得以成功表(biao)(biao)達和純化(hua)。

在(zai)篩選192種表達(da)條件(jian)并純(chun)化30種以確定(ding)預測產(chan)量(liang)后，每種CD19變體的合(he)適條件(jian)被放大，在(zai)24小時(shi)內(nei)生產(chan)出微克級蛋白(bai)用(yong)于下游應用(yong)。SDS-PAGE分析(xi)證(zheng)(zheng)實(shi)所有(you)CD19變體均成功表達(da)，其中N端ECD純(chun)度達(da)88%，C端胞內(nei)結(jie)構域(yu)純(chun)度達(da)100%，但(dan)全長蛋白(bai)純(chun)度較低(di)（圖(tu)4A）。通過內(nei)部熒光測定(ding)和(he)SDS-PAGE進行(xing)的蛋白(bai)產(chan)量(liang)定(ding)量(liang)與(yu)預測產(chan)量(liang)高(gao)度吻合(he)，證(zheng)(zheng)明了(le)該系統(tong)從篩選到放大的可靠性（圖(tu)4B）。總(zong)體結(jie)果證(zheng)(zheng)實(shi)了(le)eProtein Discovery系統(tong)在(zai)明顯加速高(gao)質量(liang)復雜蛋白(bai)生產(chan)方面的有(you)效性和(he)精確性。

圖4. CD19放大生產結果。（A）使(shi)用優化后的eGene/無(wu)細胞混(hun)合物在200 μL體(ti)系中表達并純化的CD19長度變體(ti)的SDS-PAGE分(fen)析（FT=流出液）。

圖4. CD19放大(da)生產結果(guo)。（B）通過內(nei)部(bu)熒光測(ce)定(ding)和SDS-PAGE確定(ding)的(de)蛋白產量(liang)與系統預測(ce)產量(liang)的(de)對比。

四、結論

通過(guo)同步(bu)測試不同CD19蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)構建序列、可溶性標簽及(ji)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)表(biao)達(da)參數，eProtein Discovery可在24小時內(nei)快速確定合(he)適的(de)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)表(biao)達(da)條件，并在48小時內(nei)獲得目標蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)。這一能(neng)力使(shi)(shi)研究人(ren)員能(neng)夠快速開(kai)(kai)展(zhan)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)靶點(dian)鑒(jian)定及(ji)疾(ji)病(bing)機(ji)制相(xiang)關(guan)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)驗證工作。該系統(tong)整合(he)數字微(wei)流控技術、蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)質(zhi)量分析及(ji)無細胞(bao)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)合(he)成技術，即使(shi)(shi)對于(yu)最難表(biao)達(da)的(de)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)也(ye)能(neng)實現快速制備，從(cong)而大(da)幅簡化了治療性研究與(yu)開(kai)(kai)發(fa)的(de)流程。

KEY英國Nuclera公(gong)司由劍橋大學的(de)(de)(de)博士生們(men)(men)于2013年創立。在撰寫論(lun)文期間，他(ta)們(men)(men)發(fa)現蛋白(bai)質難以獲取(qu)的(de)(de)(de)問題(ti)(ti)是(shi)生物(wu)學領域(yu)的(de)(de)(de)重要障礙(ai)(ai)和瓶頸。他(ta)們(men)(men)著手解決蛋白(bai)質難以獲取(qu)的(de)(de)(de)問題(ti)(ti)，以期改善(shan)人類健(jian)康狀況。公(gong)司的(de)(de)(de)愿景是(shi)打造出從(cong)DNA到(dao)蛋白(bai)質的(de)(de)(de)原型設計系統，以減少在藥物(wu)發(fa)現計劃中獲得靶蛋白(bai)的(de)(de)(de)時(shi)間和障礙(ai)(ai)。

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