展會預告

由中國生物物理學會、中國科學院生物物理研究所主辦，“第二十一次生物物理大會”將于2025年7月31日-8月3日在四川省成都市世紀城國際會議中心召開。

此次大會以“生物物理與人類健康”為主題，聚焦生物物理及相關研究領域的近期進展、技術趨勢與難點問題。上海曼博生物積極探索蛋白表達&純化篩選領域，將攜英國Nuclera公司的eProtein Discovery微流控無細胞蛋白表達系統亮相。

該系統也被稱作體外轉錄/翻譯系統，能夠實現蛋白質的快速原型設計。該系統采用數字微流控卡盒和定制試劑，可針對多達192種條件篩選蛋白質表達與可溶性，包括在8種無細胞表達條件下對至多24種構建體的篩選。可在48小時內完成從DNA到蛋白質篩選與放大生產，歡迎各位蒞臨B35展臺與我們交流探討。

使用eProtein Discovery系統快速無細胞表達和純化VEGF165，并使用Biacore系統驗證其活性

一、引言

傳(chuan)統的(de)蛋白質優(you)(you)化與獲取方法(fa)往往耗(hao)時數周甚至數月，尤其當表達(da)出(chu)的(de)蛋白質出(chu)現不溶、折疊異常或失去活性等問題(ti)時，研究人員還需用新構建體對蛋白質優(you)(you)化流程(cheng)進行多(duo)次重復操作。這不僅令人倍(bei)感挫敗(bai)，更(geng)會造成高昂(ang)的(de)成本消(xiao)耗(hao)與大量的(de)時間浪費。

我(wo)們整合了兩(liang)款前沿生命(ming)科學工具，形成一套提效解(jie)決方案：通過(guo)eProtein Discovery系統(tong)(tong)實現(xian)蛋白質(zhi)(zhi)的快速獲取，借助Biacore SPR系統(tong)(tong)開展蛋白質(zhi)(zhi)間(jian)相互作(zuo)用研(yan)究，以此驗(yan)證蛋白質(zhi)(zhi)的功能(neng)活(huo)性。我(wo)們以一種(zhong)難以表達且已知含(han)有二硫鍵的蛋白質(zhi)(zhi)——血管內皮生長因子165（VEGF165）為例，展示該(gai)系統(tong)(tong)的工作(zuo)流程。

二、方法

1、利用eProtein Discovery系統進行蛋白表達(da)&純(chun)化篩選(xuan)及規(gui)模(mo)放(fang)大

eProtein Discovery系統是一個集成化(hua)系統，僅需3個簡(jian)單步驟即可實(shi)現(xian)蛋白質(zhi)的快速獲取（圖(tu)1）。

圖1：eProtein Discovery工作(zuo)流程

圖2：eProtein Discovery 卡(ka)盒篩選采(cai)用熒光互補技術檢測(ce)可(ke)溶(rong)性蛋(dan)白的表達

2、Biacore檢測

Biacore SPR系(xi)統借助表面等離子(zi)體共振（SPR）現象，能夠實(shi)時監測生(sheng)物(wu)分(fen)子(zi)之間(jian)(jian)的相(xiang)互(hu)作(zuo)(zuo)用。在科研(yan)、藥物(wu)研(yan)發(fa)、質量控制(zhi)及(ji)生(sheng)產制(zhi)造領(ling)域，Biacore SPR系(xi)統是(shi)一款功能強(qiang)大的工具，可提供諸如(ru)動力學(xue)、親和力、濃度及(ji)特異性等方面的數據。本研(yan)究(jiu)中，我們使(shi)用Biacore 1S+ SPR系(xi)統（圖(tu)3），通(tong)過蛋(dan)白質間(jian)(jian)相(xiang)互(hu)作(zuo)(zuo)用研(yan)究(jiu)，探究(jiu)VEGF165與(yu)貝伐珠單抗(kang)之間(jian)(jian)的相(xiang)互(hu)作(zuo)(zuo)用。

圖3：Biacore 1S+ SPR系(xi)統配備有6個流動池，這些流動池既可單獨使(shi)用，也可組合使(shi)用，從而提(ti)高分析的靈活性(xing)

Biacore單循環動力學（SCK）用于(yu)研究VEGF165與貝伐珠單抗(kang)的結(jie)合(he)動力學。將濃度依(yi)次為(wei)0.78、1.56、3.125、6.25、12.5和25 nM的VEGF165，注射(she)到固(gu)定有(you)貝伐珠單抗(kang)（捕獲于(yu)Protein A傳感器芯片上）的體(ti)系(xi)中。

Biacore SCK方(fang)法詳(xiang)情如(ru)下：貝伐珠單抗捕獲水平(ping)為(wei)75 RU，結(jie)合(he)時間120秒，解(jie)離時間3600秒，流速(su)30 μL/分(fen)鐘(zhong)，溫(wen)度25°C，運行緩沖液為(wei)PBS-P+。實驗數據采用1:1結(jie)合(he)模型進行擬(ni)合(he)，以(yi)推導結(jie)合(he)常數。

三、結果

1、通過該儀器進行的(de)表達與(yu)純化篩選，能夠確定(ding)可產生至(zhi)高純化產量的(de)構建(jian)體(ti)與(yu)無細胞(bao)混合(he)體(ti)系組合(he)

圖4.1：表達及純化結(jie)果。(a) 棒(bang)棒(bang)糖(tang)圖顯示了在不同無細胞混合體系中表達的(de)VEGF165變體的(de)表達量

圖(tu)4.2：表達及純化結果。(b) 卡盒(he)預(yu)測的(de)放大產量(liang)，可輔助放大規劃

VEGF165的(de)高表達量是在P17標簽構建體(ti)、伴侶蛋白（TrxB1）及氧化條(tiao)件（PDI/GSSG混合(he)物）共同作用下實現的(de)（圖4）。該(gai)組合(he)通過P17可溶(rong)性融(rong)合(he)標簽的(de)存在，以及支持二硫鍵(jian)形成(cheng)的(de)添加(jia)劑，促進了(le)蛋白質的(de)可溶(rong)性表達。這(zhe)一(yi)結果與已(yi)發表的(de)研(yan)究一(yi)致，即VEGF在帶(dai)有可溶(rong)性融(rong)合(he)標簽且有助(zhu)于二硫鍵(jian)形成(cheng)的(de)大腸桿菌(jun)(jun)菌(jun)(jun)株中能(neng)良好表達。

2、放大表達可生成高產量(liang)、高純度的 VEGF165

圖5：P17-VEGF165的(de)放大(da)表達(da)與純(chun)化(hua)結果顯示，從1mL無細胞混合體系(xi)中可(ke)(ke)獲得106μg的(de)可(ke)(ke)溶性蛋白，且純(chun)度較高

3、Biacore檢測(ce)證實了VEGF165能與(yu)貝伐珠單抗(kang)發生功能性結(jie)合

圖(tu)6：傳(chuan)感器圖(tu)（藍色曲(qu)線）及1:1擬合曲(qu)線（黑色曲(qu)線），展示了(le)在Protein A傳(chuan)感器芯(xin)片捕(bu)獲(huo)的(de)貝伐珠單抗上，VEGF165的(de)Biacore單循環(huan)動(dong)(dong)力學（SCK）檢(jian)測結(jie)果。表格(ge)呈現了(le)這(zhe)些相互作用的(de)動(dong)(dong)力學參數(shu)。Biacore檢(jian)測證(zheng)實了(le)VEGF165的(de)功能活(huo)性，其(qi)親和常(chang)數(shu)（KD）為36 pM

四、結論

1、從(cong)DNA到106 μg純化(hua)蛋白的(de)時(shi)間不到48小時(shi)

2、Biacore檢測(ce)證實VEGF165與(yu)貝(bei)伐珠單(dan)抗(kang)結(jie)合具有功(gong)能活(huo)性，親和力達(da)36pM

通過eProtein Discovery系統進(jin)(jin)行(xing)快速無細胞(bao)蛋白表達與純化篩選，次日即可進(jin)(jin)行(xing)蛋白放(fang)大生產(chan)，這一組合縮(suo)短了獲取高(gao)質(zhi)量蛋白以在(zai)Biacore系統上進(jin)(jin)行(xing)功(gong)能驗(yan)證的時間。

英國Nuclera公(gong)司(si)由劍橋大(da)學的(de)(de)博士(shi)生(sheng)們(men)于2013年創立。在(zai)撰寫論文期間，他們(men)發現蛋白質難(nan)以獲(huo)(huo)取(qu)的(de)(de)問題是生(sheng)物(wu)學領域(yu)的(de)(de)首要障礙(ai)和(he)關(guan)鍵瓶頸。他們(men)著(zhu)手解決(jue)蛋白質難(nan)以獲(huo)(huo)取(qu)的(de)(de)問題，以期改善人類健康(kang)狀況。公(gong)司(si)的(de)(de)愿景是打造出從(cong)DNA到蛋白質的(de)(de)原型(xing)設計(ji)系統，以減少(shao)在(zai)藥物(wu)發現計(ji)劃中獲(huo)(huo)得靶(ba)蛋白的(de)(de)時間和(he)障礙(ai)。

上海曼博生物是Nuclera品牌的官方代理商。如咨詢產品信息，歡迎掃碼添加小助手微信聯系我們！