發布時間：2025/02/28 點擊數：401 馬臍血間充質(zhi)干(gan)細(xi)胞(eUC-MSC)在(zai)PBS垂直輪生物(wu)反應器中基(ji)于(yu)微載體的(de)高(gao)倍(bei)擴增工藝
01 摘 要
間充質干細(xi)胞(bao)(bao) (MSCs) 作為一(yi)種具有(you)免疫調節和(he)(he)分化能(neng)力的(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)，在細(xi)胞(bao)(bao)治(zhi)療領域展現(xian)出較大(da)潛(qian)力。馬MSCs (eMSCs) 在治(zhi)療馬匹的(de)(de)(de)(de)關節損傷(shang)方面(mian)尤其具有(you)優勢，例如半月(yue)板(ban)損傷(shang)、軟骨(gu)退化和(he)(he)骨(gu)關節炎。然而，eMSCs的(de)(de)(de)(de)臨床(chuang)應用面(mian)臨著(zhu)生物制造方面(mian)的(de)(de)(de)(de)挑(tiao)戰，特別是如何實現(xian)細(xi)胞(bao)(bao)數量的(de)(de)(de)(de)大(da)規模擴(kuo)增。傳統的(de)(de)(de)(de)靜態培養(yang)方法無(wu)法滿足臨床(chuang)應用的(de)(de)(de)(de)需求(qiu)，而生物反應器技術則提(ti)供了一(yi)種可行的(de)(de)(de)(de)解決方案。
02 擴(kuo)增工藝和結果(guo)展示
1. 垂直輪生物(wu)反應器：eMSCs放(fang)大生產的理(li)想系統
PBS生物(wu)技術公(gong)司開發(fa)的(de)(de)垂(chui)(chui)直輪(lun)式 (VW) 生物(wu)反(fan)應(ying)器(qi)，是eMSCs的(de)(de)放大(da)生產(chan)的(de)(de)理想系統。垂(chui)(chui)直輪(lun)生物(wu)反(fan)應(ying)器(qi)獨特的(de)(de)混合模式，結(jie)合了徑向(xiang)和軸向(xiang)流體流動，有效地降(jiang)低了剪切(qie)應(ying)力，同時實(shi)現(xian)了效率更高的(de)(de)混合，從而(er)為細胞生長提供(gong)了更好的(de)(de)環境。
2. 研究團隊通過三個不(bu)同(tong)規模(mo)的放大實驗，驗證了垂直輪生(sheng)物(wu)反應器在eMSCs放大生(sheng)產中的優勢
圖1.eCB-MSCs在垂直輪生物反應器(qi)中(zhong)放大擴(kuo)增的(de)研究設計(ji)示意(yi)圖
（A）從(cong)0.1升到0.5升垂直輪生物反應器的規(gui)模(mo)放大；
（B）直(zhi)接從靜態培(pei)養中在3L垂直(zhi)輪生(sheng)物(wu)反應器中的(de)擴增；
（C）模擬的規模放大過(guo)程，用于細胞治療，包括兩(liang)次靜態傳代，隨后進(jin)行兩(liang)次生(sheng)物反應器傳代。
2.1 從(cong)0.1L到0.5L的(de)放大
這是放大生(sheng)產(chan)的(de)(de)(de)第(di)一步，將eCB-MSCs從(cong)0.1L規(gui)模(mo)(mo)的(de)(de)(de)垂直輪生(sheng)物反(fan)應(ying)(ying)器(qi)(qi)轉移至0.5L規(gui)模(mo)(mo)的(de)(de)(de)垂直輪生(sheng)物反(fan)應(ying)(ying)器(qi)(qi)。結果顯示，兩種(zhong)規(gui)模(mo)(mo)的(de)(de)(de)生(sheng)物反(fan)應(ying)(ying)器(qi)(qi)在細胞擴(kuo)增方面取得(de)了相似的(de)(de)(de)效果，證明了垂直輪生(sheng)物反(fan)應(ying)(ying)器(qi)(qi)在較小規(gui)模(mo)(mo)上的(de)(de)(de)可擴(kuo)展性(xing)。
圖(tu)2.eCB-MSCs在(zai)0.1L垂(chui)直輪(lun)生(sheng)物反應器中的(de)擴增，并傳代至0.5L垂(chui)直輪(lun)生(sheng)物反應器（生(sheng)物工藝A）
（A）0.1升和0.5升垂直輪生(sheng)物(wu)反應器中(zhong)細(xi)胞附著(zhu)密(mi)度的變化；
（B）0.1升和(he)0.5升垂直輪(lun)生物反應器中的收獲(huo)細胞密度(du)；
（C）不同培養容器中eCB-MSCs在(zai)不同天數的生長圖像(xiang)（綠(lv)色熒(ying)光為細胞核(he)染色）。
2.2 將(jiang)靜態(tai)培養與(yu)計算機控制的PBS 3L生物反(fan)應器進行比較(jiao)
為了驗證(zheng)3L生物反應器在(zai)放(fang)大(da)生產中(zhong)的優勢，研究團隊將其(qi)與靜態培養進行了比較。3L生物反應器通過計算機控(kong)制系統維持了更好(hao)的pH、溶氧量和溫度，最(zui)終細(xi)胞(bao)密(mi)度達到(dao)1.5 × 105細(xi)胞(bao)/cm2，收獲了1.5 × 109個細(xi)胞(bao)，證(zheng)明(ming)了其(qi)在(zai)放(fang)大(da)生產中(zhong)的優勢。
圖3.eCB-MSCs在3L垂直(zhi)輪(lun)生(sheng)物(wu)反(fan)(fan)應器中的(de)擴增(zeng)，與0.1L垂直(zhi)輪(lun)生(sheng)物(wu)反(fan)(fan)應器和靜(jing)態培養的(de)對比（生(sheng)物(wu)工藝(yi)B）
（A）在不同(tong)培(pei)養容器中細胞附(fu)著密度的變化；
（B）3L垂直輪(lun)生物反應器中的(de)CO2控制輸入；
（C）3L垂直輪生物反應(ying)器中的氧(yang)氣(qi)控制輸入及溶解氧(yang)（DO）測量；
（D）不同培養容(rong)器中在線和離線pH值測量的變化；
（E）第5天eCB-MSCs在(zai)微載體上(shang)和靜態培養中的生長(chang)圖(tu)像（綠色(se)熒光為細(xi)胞核染色(se)，藍色(se)為肌動蛋白(bai)染色(se)）。
2.3 模擬臨床(chuang)試驗流(liu)程，從靜態培養放大到(dao)3L計算機控制生物反(fan)應器
為了更接近真實的(de)臨(lin)床(chuang)試驗流(liu)程，研究團隊模擬了從靜態培(pei)養到3L計算機控制生物(wu)反應(ying)器的(de)放(fang)大過程。結果(guo)顯示，細胞(bao)擴增效(xiao)率(lv)和細胞(bao)質量(liang)均(jun)保持(chi)穩定，進(jin)一步驗證了垂(chui)直輪生物(wu)反應(ying)器在放(fang)大生產中(zhong)的(de)可行性(xing)和穩定性(xing)。
圖(tu)4. eCB-MSCs在模擬(ni)臨床試驗生物(wu)工藝(yi)（生物(wu)工藝(yi)C）中的擴增
（A）在不同培養(yang)容器中細胞附著密(mi)度的變化。誤差(cha)條表示(shi)樣本間的標準差(cha)；
（B）3L垂直(zhi)輪(lun)生物(wu)反應器中的控制CO2輸入及在線(xian)pH值；
（C）3L垂(chui)直輪生物反應器(qi)中的控制氧(yang)氣輸(shu)入及溶解氧(yang)（DO）測量(liang)；
（D）第5天eCB-MSCs在微(wei)載體上和靜態培養(yang)中的(de)生長圖像(xiang)（綠(lv)色(se)熒光為細(xi)胞核染(ran)色(se)，藍(lan)色(se)為肌(ji)動蛋白染(ran)色(se)）；
（E）每個下游處理步驟中的(de)收(shou)獲效率(lv)和細胞損失情況。
2.4 擴(kuo)增的eCB-MSCs功能與表型(xing)分析(xi)
研究團(tuan)隊(dui)對放(fang)大(da)生(sheng)產后的eCB-MSCs進行了功能和表(biao)型分(fen)析。結果顯(xian)示，eCB-MSCs在細胞表(biao)型、功能和免疫(yi)調節能力方面均(jun)保持穩(wen)定(ding)，滿足臨(lin)床應用的要求。
圖5.在生物工藝B（A–C）和(he)生物工藝C（D–F）中擴增的(de)eCB-MSCs功能和(he)表型(xing)
（A）生物(wu)工藝B細(xi)胞分(fen)析的(de)示(shi)意圖；
（B）體外軟骨分化的組織學評估(gu)，使用托魯藍染色(se)（i–iii）和蘇木(mu)精-伊紅染色(se)（iv–vi）（i和iv - 3L生物反(fan)應(ying)器(qi)，ii 和 v- 0.1升(sheng)生物反(fan)應(ying)器(qi)，iii 和vi-靜(jing)態培(pei)養(yang)）；
（C）eCB-MSC標志物(wu)和外(wai)周血單(dan)核細(xi)胞（PBMC）分析的流式細(xi)胞術結(jie)果(guo)，用于生(sheng)物(wu)工藝B；
（D）生物工藝C分析(xi)的細胞的示意圖；
（E）體外軟骨分化的組織(zhi)學評估，使用托魯藍(lan)染色（i–iii）和(he)(he)蘇木(mu)精-伊紅(hong)染色（iv–vi）（i和(he)(he)iv - 3L生(sheng)物(wu)反應器，ii 和(he)(he) v- 0.5升生(sheng)物(wu)反應器，iii 和(he)(he)vi - 靜態培養）；
（F）eCB-MSC標志(zhi)物和PBMC的(de)(de)流式細(xi)胞術分析，陽性對照為用(yong)ConA處(chu)理的(de)(de)淋(lin)巴(ba)細(xi)胞，陰性對照為未用(yong)ConA處(chu)理的(de)(de)淋(lin)巴(ba)細(xi)胞。
2.5 細胞靜態恢復(fu)實驗(yan)
為了評估3L垂(chui)直(zhi)輪(lun)生物反(fan)應(ying)器中(zhong)收(shou)獲(huo)的(de)eCB-MSCs的(de)增殖潛力(li)，研(yan)究(jiu)團隊進(jin)行了細胞(bao)靜態(tai)恢復實驗(yan)。結(jie)果顯示，3L垂(chui)直(zhi)輪(lun)生物反(fan)應(ying)器中(zhong)收(shou)獲(huo)的(de)eCB-MSCs具有更(geng)高的(de)增殖潛力(li)。
圖6.從(cong)3L垂直輪生物反應器中(zhong)收(shou)獲的eCB-MSC的靜態恢(hui)復(fu)與生物工藝C中(zhong)的靜態培養(yang)相當
（A）實驗設置的示意圖(tu)；
（B）接(jie)種1天后細(xi)胞附(fu)著在T形瓶中的分(fen)析；
（C）收獲的細胞在培養6天(tian)后的倍增(zeng)情況(kuang)，比較了(le)從3L垂直輪(lun)生(sheng)物反應器和靜態T形瓶中收獲的細胞；
（D）接種1天和6天后(hou)，從(cong)3L垂直輪生物反應器或靜態T形瓶(ping)中傳代的細胞圖像。
2.6 理論細胞產量
理論細(xi)胞產(chan)(chan)量計算部分：基于(yu)Bioprocess C的理論細(xi)胞產(chan)(chan)量計算，通過垂直輪生物反應器(qi)進行放(fang)大生產(chan)(chan)，按照起始細(xi)胞量接種7.5e5個細(xi)胞，經(jing)4代放(fang)大培養，可收(shou)獲約760億(yi)個細(xi)胞高質量eCB-MSCs，滿足臨床(chuang)應用的需求。
圖7.使(shi)用在模(mo)(mo)擬臨床試驗規模(mo)(mo)擴增(zeng)生物工(gong)藝（生物工(gong)藝C）中(zhong)每次傳代獲(huo)得的收獲(huo)細(xi)(xi)胞(bao)數，計算的理論細(xi)(xi)胞(bao)產量，以及每次傳代所需的相應體積
03 未來展(zhan)望
未來(lai)研(yan)究可(ke)以進一(yi)步優化下游處理步驟，提高細胞收獲效率。此外，還需要進行更多的(de)(de)研(yan)究，以確認垂(chui)直(zhi)輪(lun)生(sheng)物反應器放大生(sheng)產的(de)(de)eCB-MSCs在體內(nei)也具(ju)有相(xiang)似的(de)(de)免疫調節和分化能力。
04 總結
PBS垂直輪(lun)生(sheng)物反應器為eMSCs的(de)放大生(sheng)產提供(gong)了(le)理想的(de)平(ping)臺，為eMSCs的(de)臨床應用帶來了(le)新的(de)希望。這項研究(jiu)為eMSCs生(sheng)物制造(zao)領域的(de)發展開辟了(le)新的(de)道路，為馬(ma)匹(pi)和(he)其他動(dong)物的(de)健康帶來了(le)福音。
垂直輪生物反(fan)應(ying)器的優勢
· 可擴(kuo)展性：垂(chui)直(zhi)輪生物(wu)反應器獨特(te)的(de)混合模式(shi)使其(qi)能夠在不同(tong)規模上保(bao)持相(xiang)似的(de)流體(ti)動(dong)力學特(te)性，從而實(shi)現細胞擴增效率(lv)的(de)穩定(ding)。
· 控制性：計算機控制系統可以精確控制pH、溶氧量和溫度等關鍵參數，確保細胞在更好的環境中生長。
· 效率(lv)高：垂直輪生物反應器的(de)效率(lv)更高的(de)混合和細胞附著特性，可以更大程(cheng)度提高細胞擴(kuo)增效率(lv)和收獲率(lv)。
· 效率高的低剪切力懸浮體系：基于微載體培養(yang)的(de)細(xi)胞得到成(cheng)分懸浮培養(yang)，細(xi)胞質(zhi)量良好。放(fang)大(da)生(sheng)產后的(de)eCB-MSCs在細(xi)胞表(biao)型、功(gong)能和免疫調節(jie)能力方面(mian)均保持穩定(ding)，滿足臨床應(ying)用的(de)要(yao)求。
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