發布時間：2025/03/20 點擊數：600 一、背景介紹(shao)
1月(yue)2日，藥監(jian)局通(tong)過優先審(shen)評(ping)審(shen)批(pi)程序(xu)附條件批(pi)準了我國初個干(gan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)治(zhi)療(liao)藥品艾米邁托賽(sai)注射液上(shang)市，用(yong)于(yu)治(zhi)療(liao)14歲以上(shang)患者在造血干(gan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)移植后出現的并發癥(zheng)。這標志著(zhu)國內細(xi)胞(bao)(bao)(bao)治(zhi)療(liao)領域取(qu)(qu)得(de)重要(yao)進展，增強(qiang)了市場信(xin)心。同時(shi)，先博生物宣布其通(tong)用(yong)型異體CD19 CAR-NK藥物SNC103在治(zhi)療(liao)復發和/或難治(zhi)性(xing)大B細(xi)胞(bao)(bao)(bao)淋巴瘤(liu)的一期臨床試驗中取(qu)(qu)得(de)積極結果，進一步推動(dong)了NK細(xi)胞(bao)(bao)(bao)療(liao)法的發展。
自然(ran)殺傷（NK）細(xi)(xi)胞(bao)(bao)是免(mian)疫系統中的(de)(de)(de)(de)一類淋巴細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，能(neng)夠在(zai)不經過(guo)預先(xian)致敏的(de)(de)(de)(de)情(qing)況下靶向并摧毀腫(zhong)瘤細(xi)(xi)胞(bao)(bao)和(he)病原體(ti)(ti)。異(yi)體(ti)(ti)NK細(xi)(xi)胞(bao)(bao)治(zhi)(zhi)療(liao)(liao)在(zai)免(mian)疫治(zhi)(zhi)療(liao)(liao)，尤其是癌癥治(zhi)(zhi)療(liao)(liao)領(ling)域顯示出較大(da)潛力。然(ran)而，傳統的(de)(de)(de)(de)擴(kuo)增平臺缺乏快(kuai)速(su)從早期工藝開發(fa)到商(shang)業(ye)化(hua)規(gui)(gui)模制造所需的(de)(de)(de)(de)適當的(de)(de)(de)(de)規(gui)(gui)模范圍。橫向擴(kuo)展（scale-out）模型通常用于自體(ti)(ti)治(zhi)(zhi)療(liao)(liao)，這使得批次間變異(yi)性增加(jia)，成本效(xiao)益降低，并增加(jia)過(guo)程(cheng)驗證(zheng)的(de)(de)(de)(de)復雜性，最(zui)終延誤了細(xi)(xi)胞(bao)(bao)療(liao)(liao)法(fa)的(de)(de)(de)(de)進展和(he)患者(zhe)接受治(zhi)(zhi)療(liao)(liao)的(de)(de)(de)(de)時間。
PBS垂直輪(lun)生(sheng)物(wu)反(fan)應器（PBS Biotech）通(tong)過(guo)支持60mL（PBS Mini 0.1L）至(zhi)80L工(gong)作體積的(de)(de)細胞擴(kuo)增解決了這(zhe)一(yi)需求，使(shi)得(de)多(duo)個工(gong)藝參數可以在小(xiao)體積上測試、優(you)化(hua)，并將其轉化(hua)至(zhi)更大規模的(de)(de)系統，最終實現治療所需要的(de)(de)功能性NK細胞的(de)(de)高產量擴(kuo)增。
二(er)、材料與方法(fa)
2.1 小規模擴增
對兩個(ge)供體的冷凍(dong)保存白細(xi)胞分離(li)物進(jin)行解凍(dong)，并通過Ficoll梯度分離(li)出外周(zhou)血單個(ge)核(he)細(xi)胞（PBMCs）。使用磁珠分離(li)法去除CD3+細(xi)胞，隨后富(fu)集(ji)CD56+細(xi)胞。
培(pei)(pei)養(yang)與(yu)擴(kuo)增：將CD3-/CD56+ NK細(xi)胞(bao)種植在(zai)無飼養(yang)層細(xi)胞(bao)培(pei)(pei)養(yang)基中(zhong)，補(bu)充人AB血清和細(xi)胞(bao)因子(zi)。在(zai)第(di)7天(tian)，對(dui)細(xi)胞(bao)進(jin)行計數并(bing)重新(xin)種植到6M G-Rex燒(shao)瓶（Wilson Wolf Manufacturing）或PBS-0.5（至大工作體(ti)積(ji)為100mL G-Rex或500mL PBS）中(zhong)。在(zai)第(di)13天(tian)，使用離心法收集(ji)細(xi)胞(bao)，并(bing)使用控(kong)速(su)冷(leng)(leng)凍(dong)儀冷(leng)(leng)凍(dong)在(zai)冷(leng)(leng)凍(dong)管中(zhong)。
圖1.對比PBS垂直輪(lun)生(sheng)物反應器與G-Rex靜態反應器中小規模供體來源(yuan)的(de)NK細胞(bao)擴增工作(zuo)流程(cheng)
2.2 PBS 3L中(zhong)NK細胞(bao)擴(kuo)增及模擬大規模（80L）擴(kuo)增
通過保持細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)懸浮液與新(xin)鮮培(pei)(pei)養(yang)基(ji)的(de)比(bi)例，使用3L垂(chui)直輪生物反(fan)應器（PBS-3）與已優(you)化的(de)G-Rex工藝進行(xing)比(bi)較(jiao)。將3個供(gong)體(ti)的(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)種植在(zai)含有(you)無飼養(yang)層細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)培(pei)(pei)養(yang)基(ji)的(de)燒瓶(ping)中，并(bing)在(zai)第(di)5天(tian)添加培(pei)(pei)養(yang)基(ji)。在(zai)第(di)7天(tian)，對(dui)(dui)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)進行(xing)計(ji)數并(bing)重新(xin)種植到(dao)6M G-Rex或PBS-0.5中。在(zai)第(di)9天(tian)，對(dui)(dui)PBS-0.5中的(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)計(ji)數并(bing)將120mL細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)懸浮液重新(xin)種植到(dao)PBS-3中，加入1.88L細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)培(pei)(pei)養(yang)基(ji)。設定攪拌(ban)速率為30RPM，并(bing)在(zai)第(di)11天(tian)添加新(xin)鮮培(pei)(pei)養(yang)基(ji)以(yi)達到(dao)3.0L至大體(ti)積。G-Rex擴增在(zai)第(di)13天(tian)達到(dao)平(ping)臺期并(bing)收獲(huo)，PBS-3培(pei)(pei)養(yang)在(zai)第(di)15天(tian)收獲(huo)。對(dui)(dui)解凍后(hou)的(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)活性和細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)毒性進行(xing)評估(gu)。
圖2.G-Rex與PBS中的培養工(gong)藝(yi)及后續模擬PBS-80L中NK細胞放大擴增的工(gong)作流(liu)程
其中，在Day9，對PBS 3L中的(de)細胞進行(xing)(xing)計(ji)數，模擬將(jiang)所有細胞從PBS 3L轉移到PBS-80 (60L +培養(yang)(yang)基(ji)添加到80L)，培養(yang)(yang)至D15進行(xing)(xing)收獲。
三、結(jie)果
3.1 攪拌速(su)度對細胞產量和(he)細胞毒性的影響
PBS垂直(zhi)輪生物反(fan)應器在(zai)每個攪拌速度下均(jun)顯(xian)示出(chu)優于(yu)G-Rex的累積倍數(shu)擴增（CFE）和(he)(he)EC:50（使用EC:50測定(ding)法，測量NK細(xi)胞(bao)在(zai)暴(bao)露于(yu)K562細(xi)胞(bao)時達到(dao)更大(da)細(xi)胞(bao)毒性反(fan)應一半所(suo)需的細(xi)胞(bao)數(shu)量）。100RPM的攪拌速率(lv)(lv)下兩個供體的擴增率(lv)(lv)更高，活性更強。增加攪拌速度與NK細(xi)胞(bao)擴增和(he)(he)改善細(xi)胞(bao)毒性反(fan)應相關（如下圖3所(suo)示）。
圖(tu)3. (A)與靜(jing)態G-Rex培養相比(bi)，垂直輪(lun)生物反(fan)應(ying)器（20、50和100RPM實驗(yan)組）在每個攪拌速度下都表現(xian)出優越的擴增倍數。
(B) 垂直輪生物反應器(qi)在所有攪拌(ban)速度下都表(biao)現出(chu)優于G-Rex的EC:50。攪拌(ban)率為(wei)100RPM時，兩種供體擴增率高(gao)，效力(li)強(qiang)。
3.2 模擬大規模（80L）擴增
在(zai)PBS-3中(zhong)擴(kuo)增的(de)(de)(de)NK細胞比G-Rex多出約1million個(ge)細胞/mL（圖4A），CFE (累積擴(kuo)增倍(bei)數(shu))比G-Rex高1,750倍(bei)（CFE數(shu)據未(wei)顯(xian)示）。解(jie)凍(dong)后的(de)(de)(de)RCU測量顯(xian)示，在(zai)2:1 E:T比例下，PBS-3與G-Rex的(de)(de)(de)細胞毒性單位沒(mei)有較大(da)差異（數(shu)據未(wei)顯(xian)示）。解(jie)凍(dong)后的(de)(de)(de)NK細胞存(cun)活率在(zai)PBS-3與G-Rex中(zhong)相當（數(shu)據未(wei)顯(xian)示）。
圖4. (A) 產量(liang)上垂直輪生物(wu)反應(ying)器（VW，0.1L，0.5L和(he)3L數據統計）平均能達到360萬個細胞/mL，而G-Rex平均能達到260萬個細胞/mL。
(B)為(wei)PBS 3L中擴增收獲的活細(xi)胞(bao)總(zong)數（pTVC）接種至垂直輪生物反應器(qi)中，為(wei)2.8E11個(ge)細(xi)胞(bao)，G-Rex為(wei)5E10個(ge)細(xi)胞(bao)。
為了(le)比較垂直輪生(sheng)物反(fan)應(ying)器與G-Rex在(zai)至大體積下預(yu)測(ce)的總(zong)細(xi)胞(bao)(bao)產(chan)(chan)量(liang)，基(ji)于6M G-Rex收獲(huo)細(xi)胞(bao)(bao)的計數，計算(suan)了(le)在(zai)第7天(tian)需要(yao)種植4個(ge)(ge)(ge)500M G-Rex（5L工作體積）。根據不同反(fan)應(ying)器中平均每毫(hao)升收獲(huo)的細(xi)胞(bao)(bao)數，4個(ge)(ge)(ge)500M G-Rex總(zong)共能產(chan)(chan)生(sheng)500億(yi)個(ge)(ge)(ge)細(xi)胞(bao)(bao)，而(er)PBS-80模擬預(yu)測(ce)在(zai)15天(tian)培養期后(hou)總(zong)共能產(chan)(chan)生(sheng)2840億(yi)個(ge)(ge)(ge)NK細(xi)胞(bao)(bao)。
圖(tu)5.為了生(sheng)產(chan)2840億個NK細胞(bao)，G-Rex需要比(bi)Vertical-Wheel多(duo)2.5倍的(de)培養基和一次性耗(hao)材成本和4倍的(de)人員投入(ru)
四、討論
需要進(jin)一步的探索來確定更(geng)高的NK細(xi)胞(bao)(bao)(bao)功能性(xing)和產量所需的更(geng)佳攪(jiao)拌范圍。然(ran)而，這里的初步數據展(zhan)示了垂直輪(lun)作為NK細(xi)胞(bao)(bao)(bao)擴增平臺(tai)相對于G-Rex的適用(yong)(yong)性(xing)和優勢，G-Rex是(shi)免疫細(xi)胞(bao)(bao)(bao)類型(xing)常(chang)用(yong)(yong)的擴增選擇。此外，常(chang)見平臺(tai)如(ru)G-Rex和搖擺(bai)式細(xi)胞(bao)(bao)(bao)袋，在可擴展(zhan)性(xing)方面有所限制，不利(li)于異體細(xi)胞(bao)(bao)(bao)療(liao)法(fa)過程。
正(zheng)如PBS-80模擬所示，為了(le)達到(dao)使用(yong)垂直輪生(sheng)物反應器獲(huo)得(de)的2840億(yi)個NK細(xi)(xi)胞(bao)，需(xu)要(yao)24個500M G-Rex。在G-Rex中(zhong)擴增2840億(yi)細(xi)(xi)胞(bao)估計需(xu)要(yao)2.5倍的培養(yang)基(ji)和一次性耗材成(cheng)本，以及比垂直輪大規模擴增所需(xu)的人員多4倍。
五、結論
這項研(yan)究展(zhan)示了(le)垂直輪生物反應器在NK細胞擴增和規模化(hua)中的(de)潛力(li)。與傳統的(de)G-Rex相比(bi)，垂直輪生物反應器提供了(le)更高的(de)細胞產量和活性，同時降低(di)了(le)成(cheng)本和人員(yuan)需求。這為異體NK細胞治(zhi)療的(de)發展(zhan)提供了(le)一個有前景的(de)選擇，有望加速從早期開發到商(shang)業化(hua)生產的(de)進(jin)程。
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