隨著細胞治(zhi)療領(ling)域的(de)(de)快速發展，穩定、可重復的(de)(de)iPSC擴增(zeng)成為推動治(zhi)療的(de)(de)關鍵。通過(guo)系統化的(de)(de)生物過(guo)程(cheng)(cheng)設計，識別(bie)并優(you)化關鍵過(guo)程(cheng)(cheng)輸入(ru)變量(liang)，實現了iPSC在PBS垂直輪反應器內擴增(zeng)的(de)(de)穩健性(xing)與可重復性(xing)，減少生產(chan)成本和周期，為大(da)規模生產(chan)和臨床應用提供保障。

一、生物(wu)反應器微縮模型—優化iPSC工作流程的效率經(jing)濟工具

誘導多能干細(xi)胞(bao)（iPSC）及其衍生特化細(xi)胞(bao)的(de)(de)生產流程(cheng)既復雜又漫長(chang)，涉及多個(ge)相互(hu)依賴的(de)(de)工藝輸入變量(liang)（PIVs）。對于臨(lin)床應用所(suo)需的(de)(de)大(da)批量(liang)iPSC衍生細(xi)胞(bao)（超過10^8個(ge)細(xi)胞(bao)），大(da)規(gui)(gui)(gui)模(mo)生物(wu)反(fan)應器是(shi)不可(ke)或缺的(de)(de)。然而，運行大(da)規(gui)(gui)(gui)模(mo)反(fan)應器的(de)(de)成本高昂，因此，在確保(bao)細(xi)胞(bao)產量(liang)和質(zhi)量(liang)的(de)(de)同時，首先需要開發出(chu)在小(xiao)規(gui)(gui)(gui)模(mo)（100-500 mL）下可(ke)重復且穩健的(de)(de)過程(cheng)。

圖1a.一個iPSC制(zhi)造(zao)過程(cheng)的(de)示例，其(qi)中每(mei)個單元(yuan)操作及(ji)單元(yuan)操作之間的(de)過渡都會(hui)引入新(xin)的(de)工藝(yi)輸入變量（PIVs）。過程(cheng)輸出變量（POVs），如(ru)細胞產量、活力、生長速(su)度、形態、身(shen)份特性、功能、基因(yin)組(zu)穩定性、無菌等，都取決于每(mei)個PIV的(de)影響總和。

在生物(wu)工(gong)藝開發的過(guo)程(cheng)中(zhong)，PBS Biotech明確了以下關鍵概(gai)念：

1.種子培(pei)養(yang)階段(duan)（Seed train）：培(pei)養(yang)足夠(gou)數量的細(xi)胞，以便接種到生(sheng)產階段(duan)的生(sheng)物反應器中。

2.可復制性（Reproducible）：在(zai)相(xiang)同的PIVs條件下，每次運行均能獲得相(xiang)同的結(jie)果(guo)。

3.穩(wen)健(jian)性（Robust）：在不(bu)同但可比(bi)的PIVs條件下，獲得(de)的結(jie)果變化更小或可預(yu)測(ce)。

PBS Biotech通過使用微(wei)縮版的垂(chui)直(zhi)輪（VW）生(sheng)(sheng)物反應器（PBS-0.1和PBS-0.5 Mini），成(cheng)功(gong)開發了(le)(le)一套標準化(hua)的iPSC擴增(zeng)工(gong)作(zuo)流(liu)程(cheng)。該流(liu)程(cheng)不(bu)僅具有高度的穩健性和可重復性，還能(neng)輕(qing)松擴展至PBS-15（尚(shang)未測試PBS-80和PBS-500）。這一創新為iPSC生(sheng)(sheng)產提供了(le)(le)可靠的工(gong)具，有效降(jiang)低了(le)(le)開發成(cheng)本(ben)，提升(sheng)了(le)(le)生(sheng)(sheng)產效率(lv)。

圖1b. PBS垂直(zhi)輪（VW）生物反應器(qi)家族為(wei)細胞和(he)基因治療提供了溫(wen)和(he)均(jun)勻(yun)的水動(dong)力學環境(jing)，以及從(cong)早研、臨(lin)床和(he)商業化規模的一系列產(chan)品。

二(er)、iPSC生長性能指標(biao)和可重(zhong)復性研究(jiu)缺乏標(biao)準化，致使方法難以比較

在iPSC制造領域，缺(que)乏(fa)詳細(xi)的實驗方案和標準化的結果報告，導致(zhi)不(bu)同實驗室(shi)之間難(nan)以對比(bi)各種iPSC培養方法。特(te)(te)別是在3D懸浮培養方面，盡管已有多項研究報告了細(xi)胞生長性能指標（如倍(bei)增時間、特(te)(te)定生長率、細(xi)胞倍(bei)增次數(shu)和最大(da)細(xi)胞密度），但這些指標的數(shu)值(zhi)差異較大(da)，缺(que)乏(fa)一(yi)致(zhi)性。此(ci)外，干細(xi)胞制造相關文獻(xian)中，關于(yu)實驗方法和結果可重(zhong)復性的討論(lun)也很有限，進(jin)一(yi)步加劇了不(bu)同研究之間的對比(bi)難(nan)度。

三、建立穩健且(qie)可重(zhong)復的基準iPSC擴增工作流程(cheng)

通過(guo)系統(tong)化(hua)地研(yan)究關鍵(jian)工(gong)藝輸(shu)入變量（PIVs）的(de)范圍，PBS開發了一套基線(xian)iPSC擴增協議(yi)（baseline protocol，即標準化(hua)的(de)基本操作(zuo)流程），該協議(yi)旨在確保(bao)實驗(yan)的(de)可復制性(xing)和穩健性(xing)，并(bing)展示了良好的(de)結果一致(zhi)性(xing)和可靠性(xing)。該基線(xian)協議(yi)已(yi)經在兩個iPS細(xi)胞系（TC-1133，Lonza；PLX 1.0，PluriStyx）上經過(guo)24次驗(yan)證，涵(han)蓋(gai)了4名操作(zuo)員和4種不同的(de)細(xi)胞培(pei)(pei)養(yang)基（mTeSR1，STEMCELL Technologies；StemScale，Gibco；StemFlex，Gibco；HBM1，內部(bu)配(pei)方(fang)），并(bing)適(shi)用于聚集體和微(wei)載(zai)體培(pei)(pei)養(yang)。詳細(xi)的(de)細(xi)胞培(pei)(pei)養(yang)協議(yi)（包括喂養(yang)、收獲、計數和傳代）可參考Borys, B. S. 2021[2]，而生(sheng)長性(xing)能(neng)指標方(fang)程則可在Borys, B. S. 2020[3]中找(zhao)到。

圖2：

(A) 基線擴增(zeng)工作流程在種子培養階段實(shi)現的(de)平均細胞倍增(zeng)數的(de)箱線圖(tu)及須(xu)狀圖(tu)。

(B) 從2D種(zhong)子培養階(jie)段開始的累積群體倍增數，顯示出高度的可復制性。

(C, D) 基線擴增(zeng)工作流程(cheng)中，每個2D培養階段結束時的代表性iPSC克(ke)隆形(xing)態。

(E) P+3懸浮培養第(di)7天(tian)的代(dai)表性iPSC聚集體形(xing)態(tai)。

(F) P+3懸浮培養第8天，iPSC在微載體上的代表性形態(tai)；細胞(bao)免疫染色(se)結果顯示核(he)（綠(lv)色(se)）與(yu)肌動蛋白（紅色(se)）。

結果顯示(shi)在PBS 0.1L和PBS 0.5L中，分別以60RPM和40RPM的優化轉速下，以2e4個細(xi)胞(bao)(bao)/ml細(xi)胞(bao)(bao)密(mi)度進(jin)行接(jie)種，培養(yang)約6-7天，細(xi)胞(bao)(bao)能(neng)平均擴增99.3±14.1倍，最終細(xi)胞(bao)(bao)收獲密(mi)度為(wei)1.95±0.34e6個細(xi)胞(bao)(bao)/ml。重復實驗組n=46。

四、PBS-0.1 Mini上工作流程的(de)穩健性和(he)可重(zhong)復性驗證(zheng)

圖3：來(lai)自P+3 iPSC聚集體懸浮培養(yang)的(de)細胞(bao)生(sheng)長曲線，采用PBS-0.1 Mini生(sheng)物反應器中的(de)補料(liao)-批(pi)批(pi)量D3-D6 50% MX喂(wei)養(yang)方案，展示了在以下不(bu)同條件(jian)下的(de)可復(fu)制性和穩(wen)健性：

(A) 3種不同(tong)的細胞培(pei)養基；

(B) 4名(ming)不(bu)同(tong)的操作員；

(C) 2種(zhong)不(bu)同的iPS細胞系(xi)。

細胞(bao)生長曲(qu)線的圖例(li)命名規則(ze)為(wei)：實驗ID（年(nian)份，編(bian)號）_ 操作員 _ 容器 _ 培(pei)養基(ji) _ 細胞(bao)系 _ 培(pei)養基(ji)更(geng)換方法 _ 攪拌速率。

五、針對下(xia)游應用優(you)化關鍵PIVs

擬胚體(ti)（EB）的(de)(de)大(da)小和(he)密(mi)度（每毫升EB數(shu)）是iPSC聚集體(ti)分化為(wei)自然(ran)殺傷（NK）免疫(yi)細(xi)胞的(de)(de)關鍵(jian)工藝輸(shu)入變量（PIVs）。雖然(ran)目(mu)前尚未確定從iPSC EBs生成NK細(xi)胞的(de)(de)最佳EB大(da)小和(he)密(mi)度，但(dan)這些PIVs可(ke)以通過調整生物反應器的(de)(de)攪拌(ban)速(su)率（流體(ti)動力學和(he)剪(jian)切力）以及培養基更(geng)換策略來有效控制和(he)表征。

圖4：

(A) 使用(yong)PBS-0.1 Mini生(sheng)物反應器進行了攪(jiao)拌速率范圍(wei)的研究，旨(zhi)在探討(tao)攪(jiao)拌速率對EB大小和(he)密(mi)度的影(ying)響。實驗(yan)結果表(biao)明，穩健的基線擴增協議使得在較寬的攪(jiao)拌速率范圍(wei)內(nei)，細胞生(sheng)長能夠保持(chi)一致。

(B) 通過(guo)(guo)改變攪拌(ban)速率，能夠有效(xiao)地控制EB的大(da)小(xiao)(xiao)和(he)密度。未來(lai)的小(xiao)(xiao)規(gui)模(mo)分(fen)化實驗將(jiang)進一(yi)步表(biao)征產生最有效(xiao)NK細(xi)胞的較好EB大(da)小(xiao)(xiao)和(he)密度。一(yi)旦這些較好的條(tiao)件被表(biao)征出來(lai)，就可以通過(guo)(guo)保持容(rong)器中的平均能量耗散率（EDR）恒定(ding)，結合放大(da)相關方程式（Borys, B. S. 2021[2]），將(jiang)工藝放大(da)至生產規(gui)模(mo)體(ti)積。

六、將基線工作流程(cheng)從PBS 0.1擴展到PBS-15規模

圖(tu)5：

(A, B, C, D) 通過使(shi)用相同的(de)關鍵(jian)工藝輸(shu)入變(bian)量（PIVs），將工作體積(ji)從(cong)PBS-0.1的(de)100mL擴展至PBS-15的(de)10L，實現了一致的(de)iPSC生(sheng)長(chang)(chang)性能。實驗(yan)中涵蓋(gai)了不同的(de)喂養(yang)(yang)策略(lve)，包括批培養(yang)(yang)、灌(guan)注(zhu)和脈沖式添加，所有這些方法(fa)都確保了細胞生(sheng)長(chang)(chang)曲線的(de)一致性和可重(zhong)復(fu)性。

結論、iPSC及(ji)其衍生特化細(xi)胞的制(zhi)造規模生產

1.iPSC及(ji)其衍生特(te)化(hua)(hua)細(xi)胞的(de)規(gui)模化(hua)(hua)生產需要經過(guo)多輪(lun)、系統化(hua)(hua)的(de)工(gong)(gong)藝(yi)開發，確保協議的(de)穩健性(xing)和可復制性(xing)。微縮模型在這一(yi)過(guo)程中起到(dao)了至(zhi)關重要的(de)作(zuo)用，作(zuo)為一(yi)種成本效益較高的(de)工(gong)(gong)具，能(neng)夠有效支(zhi)持工(gong)(gong)藝(yi)優化(hua)(hua)。

2.通過使用PBS-0.1和PBS-0.5 VW生物反應(ying)器，PBS已經開(kai)發出一(yi)套基(ji)線的(de)iPSC擴增工作流程(cheng)，該(gai)(gai)流程(cheng)作為后(hou)續(xu)工藝優化的(de)起點。該(gai)(gai)基(ji)線工作流程(cheng)的(de)開(kai)發，考慮了細胞(bao)系(xi)、材料和時(shi)間(jian)線等限制因(yin)素，同時(shi)為下游應(ying)用提供了靈(ling)活(huo)的(de)優化空(kong)間(jian)。值得一(yi)提的(de)是，這一(yi)基(ji)線擴增工作流程(cheng)已成功放大至(zhi)PBS-15，表現出良(liang)好的(de)擴展(zhan)性和穩定性。

3.未來的工作將面臨一系(xi)列放大(da)挑戰(zhan)，特別是在控制培養基中的溶解氧(yang)、pH值(zhi)、關鍵操作的處(chu)理(li)時間(jian)以(yi)(yi)及封閉系(xi)統(tong)處(chu)理(li)方面。這些(xie)挑戰(zhan)需要解決，以(yi)(yi)確保能夠(gou)實現效率高、可靠的制造規模工藝。

為了實現可(ke)重復(fu)的(de)實驗和(he)獲得(de)功能(neng)性(xing)細(xi)胞(bao)(bao)，需要一(yi)種(zhong)能(neng)模擬體(ti)內環境的(de)化(hua)學成(cheng)(cheng)分明確(que)的(de)培養包被基質(zhi)。這就是全長(chang)的(de) Biolaminin 蛋白(bai)(bai)發揮(hui)作(zuo)用(yong)的(de)地(di)方(fang)。BioLamina品(pin)牌的(de)Biolaminin 521在培養多(duo)(duo)(duo)能(neng)干細(xi)胞(bao)(bao)、分化(hua)細(xi)胞(bao)(bao)和(he)原代(dai)細(xi)胞(bao)(bao)方(fang)面的(de)有效(xiao)性(xing)已在眾多(duo)(duo)(duo)出版物中(zhong)得(de)到(dao)了有力驗證。Laminin-521是一(yi)種(zhong)全長(chang)人重組層粘連(lian)蛋白(bai)(bai)，成(cheng)(cheng)分明確(que)、能(neng)夠支持iPSC良好地(di)附(fu)著和(he)增殖，維持細(xi)胞(bao)(bao)多(duo)(duo)(duo)能(neng)性(xing)，另外不含動物成(cheng)(cheng)分，更適合臨床應用(yong)。

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