在再(zai)生醫學的前沿，多(duo)能干(gan)細胞（PSCs）領域正迅速向臨床和(he)商(shang)業領域邁進。然而，制造過程中的可重復性和(he)穩(wen)健性為工藝開發的主要瓶頸(jing)。本研究利用垂直輪（VW）生物反應(ying)器(qi)系統，對五種PSC商(shang)業化培(pei)養基(ji)進行(xing)了短期(qi)(qi)和(he)長期(qi)(qi)擴增人類誘(you)導多(duo)能干(gan)細胞（hiPSCs）的性能評(ping)估，以期(qi)(qi)在動態培(pei)養環境中實現大(da)規模、高質(zhi)量(liang)的hiPSCs擴增。

一(yi)、研究背景(jing)

PSCs因其(qi)自我更新和多(duo)向分化(hua)能(neng)力而成為再生醫(yi)學的基石(shi)。然而，傳(chuan)統的靜態(tai)培(pei)養方法難(nan)以(yi)(yi)滿足臨床或商(shang)(shang)業(ye)(ye)應用中(zhong)對很(hen)多(duo)細(xi)胞的需求。因此，開(kai)發可擴(kuo)展(zhan)的生物反(fan)應器系統以(yi)(yi)實現(xian)(xian)PSCs的大規模擴(kuo)增顯得尤為重要。本研究旨在(zai)評估(gu)不同商(shang)(shang)業(ye)(ye)化(hua)培(pei)養基在(zai)VW生物反(fan)應器中(zhong)擴(kuo)增hiPSCs的效(xiao)果，以(yi)(yi)及(ji)這些培(pei)養基在(zai)連續傳(chuan)代中(zhong)的表現(xian)(xian)。

圖1.生物(wu)(wu)(wu)工藝(yi)過(guo)(guo)(guo)程圖，突出了一些過(guo)(guo)(guo)程輸入變(bian)量(liang)(liang)（PIVs）和過(guo)(guo)(guo)程輸出變(bian)量(liang)(liang)（POVs）的例子。在(zai)設(she)計(ji)生物(wu)(wu)(wu)過(guo)(guo)(guo)程時，考(kao)慮(lv)關鍵的PIVs以及它們將如(ru)何各(ge)自或(huo)與其他變(bian)量(liang)(liang)協同影響生物(wu)(wu)(wu)工藝(yi)過(guo)(guo)(guo)程非(fei)常重要(yao)(yao)。此外，由于生物(wu)(wu)(wu)工藝(yi)過(guo)(guo)(guo)程是(shi)一個(ge)連續且動態的過(guo)(guo)(guo)程，理解它將如(ru)何響應(ying)不同的PIVs以及對主要(yao)(yao)/關鍵POVs的影響很重要(yao)(yao)。每個(ge)框圖概述了在(zai)設(she)計(ji)過(guo)(guo)(guo)程時需要(yao)(yao)考(kao)慮(lv)的PIVs和POVs。

二、實(shi)驗方法(fa)與材(cai)料

本研究(jiu)采用(yong)為PBS垂直輪生物反應器(qi)中 PSC 聚(ju)集體(ti)短期培(pei)養(yang)而開發的基(ji)線方(fang)案，通(tong)過長期（連續傳代(dai)）懸浮培(pei)養(yang)來評(ping)(ping)估關鍵工(gong)藝屬性(xing)(xing)。這樣做是為了在使(shi)用(yong)不同市售培(pei)養(yang)基(ji)和(he)細胞(bao)系(xi)時評(ping)(ping)估整體(ti)工(gong)藝的穩健性(xing)(xing)。

本(ben)研究(jiu)用(yong)(yong)了(le)(le)三種(zhong)hiPSC細(xi)胞(bao)(bao)(bao)系(xi)：4YA、TC1133和(he)PLX1。在(zai)(zai)生物(wu)反(fan)應(ying)器培(pei)(pei)(pei)養(yang)前，細(xi)胞(bao)(bao)(bao)均在(zai)(zai)Matrigel包(bao)被的(de)(de)T-75培(pei)(pei)(pei)養(yang)瓶(ping)中使用(yong)(yong)mTeSR1培(pei)(pei)(pei)養(yang)基進行(xing)靜(jing)態(tai)培(pei)(pei)(pei)養(yang)。隨后，細(xi)胞(bao)(bao)(bao)被接種(zhong)到PBS-0.1 Mini VW生物(wu)反(fan)應(ying)器中，使用(yong)(yong)五(wu)種(zhong)不同的(de)(de)商業(ye)化培(pei)(pei)(pei)養(yang)基：mTeSR1、CTS E8、StemFlex、PluriStem和(he)NutriStem。通過維持恒定的(de)(de)攪拌(ban)速度和(he)定期的(de)(de)培(pei)(pei)(pei)養(yang)基更換(huan)，對(dui)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)生長動力學、聚(ju)集體形態(tai)、收獲效率、基因組穩定性(xing)和(he)功(gong)能性(xing)多能性(xing)等關鍵過程輸出變量（POVs）進行(xing)了(le)(le)評估(gu)。

三、研究結(jie)果

關(guan)鍵數(shu)據概覽

1、iPSC生長動力學(xue)：StemFlex培(pei)養(yang)基在(zai)6天內實(shi)現了(le)較大的(de)擴增倍數（47.0 ± 1.8），而(er)其他培(pei)養(yang)基則實(shi)現了(le)約30倍的(de)擴增。

2、iPSC聚集體形態(tai)：不(bu)(bu)同培養(yang)基的(de)平(ping)均聚集體直徑不(bu)(bu)同，CTS E8培養(yang)基展示(shi)了較大的(de)平(ping)均聚集體直徑，而PluriStem和NutriStem則(ze)較小。

3、iPSC收獲效率：StemFlex和(he)mTeSR1培養基的收獲效率接近100%，而CTS E8、PluriStem和(he)NutriStem的收獲效率分(fen)別為29%、69%和(he)47%。

4、iPSC長(chang)期連續傳代(dai)：StemFlex和(he)mTeSR1培(pei)養基在三次連續傳代(dai)中保持了一致(zhi)的細(xi)胞(bao)生長(chang)。而(er)CTS E8、PluriStem和(he)NutriStem在隨后(hou)的傳代(dai)中細(xi)胞(bao)生長(chang)減少，到(dao)第三次生物反應器(qi)傳代(dai)時幾乎沒有生長(chang)。

5、iPSC基因組(zu)穩定(ding)性(xing)(xing)和功(gong)能(neng)性(xing)(xing)多(duo)能(neng)性(xing)(xing)：通(tong)過G帶核型分(fen)析(xi)和畸胎瘤形成(cheng)實(shi)(shi)驗，證實(shi)(shi)了(le)在StemFlex培(pei)養基中培(pei)養的(de)hiPSCs在第三(san)次和第十(shi)次傳代時保持了(le)遺傳穩定(ding)性(xing)(xing)和多(duo)能(neng)性(xing)(xing)。

總結

1、在六(liu)天培(pei)養期間，測試的商(shang)業(ye)化(hua)培(pei)養基均顯示出高倍數擴(kuo)增和(he)球形聚集(ji)體形成。

2、長期(qi)連續傳代(dai)和生物反應器內解離操作揭示了細胞生長和質(zhi)量(liang)的(de)明顯差異(yi)。

3、某些商(shang)業化(hua)培養(yang)基在連續傳代培養(yang)中表現不佳，導致細胞裂(lie)解、生長速率降低和聚(ju)集(ji)體(ti)形態喪失。

4、通過(guo)多個hiPSC系的連續傳代，展示了良好的生物過(guo)程穩健性，即使在10次連續生物反應(ying)器傳代中也能維持生長和質量。

5、一些商業化培養基在生(sheng)物反(fan)應(ying)器(qi)傳代中(zhong)證明(ming)不適合，因為它們(men)在解(jie)離過程中(zhong)導致細胞裂解(jie)，降低了(le)生(sheng)長速率，并喪失了(le)聚集體形態。

6、研究強(qiang)調(diao)了系統選(xuan)擇和(he)測(ce)試生物(wu)過程輸入變量(liang)的重(zhong)要性，通過連(lian)續傳(chuan)代創建可復(fu)制和(he)穩健的協議，以實(shi)現臨床和(he)商業PSC生產。

（以下詳細(xi)數據結果，看完預計需要10分鐘(zhong)）

3.1  生物反應器培養工藝中iPSC培養基篩選

生物(wu)反應器(qi)的(de)過(guo)程輸(shu)入變(bian)(bian)量(liang)（PIVs）除了(le)(le)使(shi)用(yong)的(de)培(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)類型外都是相同的(de)。在(zai)這(zhe)些條件下，所測(ce)試的(de)培(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)都能(neng)成功地在(zai)生物(wu)反應器(qi)中(zhong)培(pei)養(yang)(yang)hiPSCs聚(ju)集(ji)體。這(zhe)通過(guo)兩個標(biao)準(zhun)來評估：（i）球(qiu)形(xing)(xing)聚(ju)集(ji)體形(xing)(xing)態(tai)，邊緣(yuan)平滑且(qie)(qie)定義明確，缺乏(fa)半透(tou)明的(de)囊狀結構(gou)；以及（ii）細胞(bao)生長(chang)(chang)沒有(you)長(chang)(chang)時間的(de)滯后階(jie)段，并且(qie)(qie)生長(chang)(chang)速率與(yu)當前文獻中(zhong)發現的(de)較大(da)值相當。后者對(dui)所有(you)測(ce)試的(de)培(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)都得到了(le)(le)支持（圖(tu)2B）。StemFlex在(zai)6天(tian)內(nei)實現了(le)(le)較大(da)的(de)擴(kuo)增倍數47.0 ± (1.8)，而其他(ta)培(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)在(zai)6天(tian)內(nei)實現了(le)(le)約30倍的(de)擴(kuo)增，如圖(tu)2C所示。關于聚(ju)集(ji)體形(xing)(xing)態(tai)，聚(ju)集(ji)體的(de)平均直徑(jing)根據測(ce)試的(de)培(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)不同而有(you)所變(bian)(bian)化；CTS E8培(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)展示了(le)(le)較大(da)的(de)平均聚(ju)集(ji)體直徑(jing)，而PluriStem和NutriStem則(ze)較小（圖(tu)2D）。在(zai)PluriStem培(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)中(zhong)也觀察到在(zai)晚期時間點球(qiu)形(xing)(xing)形(xing)(xing)態(tai)較少，而其他(ta)培(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)在(zai)整個培(pei)養(yang)(yang)期間都呈現球(qiu)形(xing)(xing)形(xing)(xing)態(tai)（圖(tu)2E）。

圖2.展示了五種不同培養基在六天內的hiPSCs生長曲線和擴增倍(bei)數

（A）為在接種到0.1 L Mini垂直(zhi)輪生(sheng)物反應(ying)器之前用于(yu)起(qi)始擴增hiPSCs的靜態種子(zi)訓練示意圖。

（B-C）在0.1 L Mini中培(pei)養的hiPSCs的六(liu)天生長(chang)曲線以(yi)及每種培(pei)養基(ji)的第六(liu)天擴增倍數

（D-E）第五天的平均聚集體(ti)直徑以及每種培(pei)養基(ji)在培(pei)養D1、D3和D5的代表(biao)性的相差(cha)顯微鏡圖像（10x）。

3.2   在垂直輪生物反應器中擴增后進行容器內iPSC聚集體的解離

在(zai)六(liu)天的(de)(de)擴增后(hou)，對(dui)所測(ce)試的(de)(de)培(pei)養(yang)基采用(yong)了一種容器(qi)(qi)內(nei)聚集體(ti)解(jie)離(li)的(de)(de)方案（如圖(tu)3A）。盡(jin)(jin)管所測(ce)試的(de)(de)商業培(pei)養(yang)基在(zai)PBS-0.1 Mini生物反應器(qi)(qi)中都成功擴增，但在(zai)使用(yong)容器(qi)(qi)內(nei)聚集體(ti)解(jie)離(li)方案后(hou)，細(xi)胞(bao)質量出(chu)現(xian)了顯(xian)著差異。如圖(tu)3B所示，StemFlex和mTeSR1培(pei)養(yang)的(de)(de)細(xi)胞(bao)聚集體(ti)獲(huo)(huo)得(de)了高(gao)收(shou)獲(huo)(huo)效率(lv)，顯(xian)示出(chu)約100%的(de)(de)恢復率(lv)。相反，CTS E8、PluriStem和NutriStem培(pei)養(yang)的(de)(de)細(xi)胞(bao)收(shou)獲(huo)(huo)效率(lv)較低，分(fen)(fen)別為29%、69%和47%。在(zai)觀察(cha)到高(gao)容器(qi)(qi)內(nei)解(jie)離(li)效率(lv)的(de)(de)情況下(xia)（mTeSR1和StemFlex），解(jie)離(li)后(hou)的(de)(de)細(xi)胞(bao)活(huo)(huo)力(li)(li)保持在(zai)90%以上，與樣本(ben)計(ji)數的(de)(de)細(xi)胞(bao)活(huo)(huo)力(li)(li)相當（圖(tu)3C）。值(zhi)得(de)注意的(de)(de)是，盡(jin)(jin)管CTS E8、PluriStem和NutriStem培(pei)養(yang)下(xia)的(de)(de)細(xi)胞(bao)計(ji)數在(zai)容器(qi)(qi)內(nei)解(jie)離(li)后(hou)明顯(xian)降(jiang)低，但細(xi)胞(bao)活(huo)(huo)力(li)(li)并沒有顯(xian)示出(chu)同樣的(de)(de)明顯(xian)下(xia)降(jiang)，分(fen)(fen)別由自動化(hua)NC-200細(xi)胞(bao)分(fen)(fen)析(xi)儀測(ce)量為88%、89%和81%。這可(ke)能表明，單活(huo)(huo)力(li)(li)參數（即或至少是本(ben)研究中使用(yong)的(de)(de)方法測(ce)量的(de)(de)活(huo)(huo)力(li)(li)）不是下(xia)游處理中細(xi)胞(bao)健康的(de)(de)好指標。

除了收獲效(xiao)率(lv)的(de)(de)(de)差(cha)異外，解(jie)(jie)離protocol對細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)質(zhi)量的(de)(de)(de)影響(xiang)還通過明場顯微鏡進(jin)行了可(ke)視化(hua)。在PBS-0.1 Mini生物反(fan)應器(qi)中用(yong)StemFlex和mTeSR1培(pei)養的(de)(de)(de)聚(ju)集(ji)體成(cheng)功解(jie)(jie)離成(cheng)主要是單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)形(xing)式，顯微鏡下或(huo)宏(hong)觀上(shang)可(ke)見(jian)的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)碎(sui)片(pian)很少。然而，在CTS E8、PluriStem和NutriStem條(tiao)件(jian)下卻產生了許(xu)多(duo)解(jie)(jie)離不佳的(de)(de)(de)聚(ju)集(ji)體和細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)碎(sui)片(pian)。這(zhe)在攪拌20分鐘后，對生物反(fan)應器(qi)內的(de)(de)(de)上(shang)清(qing)液(ye)進(jin)行宏(hong)觀比(bi)較(jiao)時更(geng)加明顯。圖3E展(zhan)示(shi)(shi)了成(cheng)功和不成(cheng)功的(de)(de)(de)容(rong)器(qi)內解(jie)(jie)離過程中觀察(cha)到的(de)(de)(de)代表(biao)性圖像，其中mTeSR1條(tiao)件(jian)被展(zhan)示(shi)(shi)為成(cheng)功的(de)(de)(de)容(rong)器(qi)內解(jie)(jie)離示(shi)(shi)例。Accutase溶液(ye)因(yin)聚(ju)集(ji)體解(jie)(jie)離產生的(de)(de)(de)濃縮單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)而變得更(geng)加渾(hun)濁，沒有宏(hong)觀可(ke)見(jian)的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)聚(ju)集(ji)體殘留或(huo)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)碎(sui)片(pian)形(xing)成(cheng)。在CTS E8條(tiao)件(jian)下，Accutase與單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)混濁度較(jiao)低，并且(qie)有許(xu)多(duo)可(ke)見(jian)的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)碎(sui)片(pian)串附著在粘性的(de)(de)(de)DNA上(shang)，表(biao)明細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)裂解(jie)(jie)。

圖3.展示(shi)了(le)在培(pei)養第(di)6天用于(yu)將(jiang)聚集體解離成單細胞的容(rong)器(qi)內解離方案的示(shi)意圖（A）

（B）展示了容(rong)器內解離過程后(hou)的收獲(huo)效率

（C）每種培養基在解(jie)離(li)前后(hou)的平均活力

（D）每(mei)種(zhong)培養基(ji)在解離協議后的細胞懸浮液的代表性相(xiang)差顯微(wei)鏡圖像（10倍放大）

（E）展示(shi)了成功(gong)解離(li)（左(zuo)面(mian)板(ban)為mTeSR1）和不(bu)成功(gong)解離(li)（右面(mian)板(ban)為CTS E8）的比(bi)較(jiao)

3.3   PBS生物反應器內連續傳代培養3代及10代后細胞的生長情況

在經過(guo)初步(bu)篩選后(hou)，五(wu)種不同的(de)商業化培(pei)(pei)(pei)養(yang)基在三輪(lun)(lun)(lun)連(lian)續培(pei)(pei)(pei)養(yang)（長(chang)(chang)時間(jian)培(pei)(pei)(pei)養(yang)）中(zhong)進行了評估。研究表(biao)明(ming)，StemFlex和(he)mTeSR1培(pei)(pei)(pei)養(yang)基在每一輪(lun)(lun)(lun)培(pei)(pei)(pei)養(yang)中(zhong)均展現了穩定(ding)的(de)細(xi)胞生長(chang)(chang)，且保(bao)持(chi)了高倍增(zeng)(zeng)效應，而CTS E8、PluriStem和(he)NutriStem培(pei)(pei)(pei)養(yang)基在連(lian)續培(pei)(pei)(pei)養(yang)中(zhong)導致細(xi)胞增(zeng)(zeng)殖減少，至第(di)(di)三輪(lun)(lun)(lun)培(pei)(pei)(pei)養(yang)時幾(ji)乎沒有生長(chang)(chang)。此外，使用StemFlex和(he)mTeSR1培(pei)(pei)(pei)養(yang)基的(de)細(xi)胞團在形(xing)態上保(bao)持(chi)正(zheng)常球形(xing)，而其(qi)他(ta)三種培(pei)(pei)(pei)養(yang)基則在二輪(lun)(lun)(lun)培(pei)(pei)(pei)養(yang)后(hou)出現形(xing)態變化，且到第(di)(di)三輪(lun)(lun)(lun)培(pei)(pei)(pei)養(yang)時，細(xi)胞的(de)增(zeng)(zeng)殖能力(li)明(ming)顯下(xia)降。

圖4.展(zhan)示(shi)了不同培養基條件下連(lian)續傳代中細胞生長和聚集(ji)體形態的變化

（A）在0.1L Mini生物反(fan)應器中(zhong)將細胞從(cong)種子培(pei)養階段連續傳代三次(ci)至第三次(ci)傳代結束的過程示意圖。

（B）三個連續(xu)傳代的生長曲線；

（C）以及每(mei)個(ge)測試培(pei)養基的累積倍增比；

（D）每個培養基在一(yi)次(ci)傳代(dai)（P1）第5天(tian)、二次(ci)傳代(dai)（P2）和三次(ci)傳代(dai)（P3）時的代(dai)表性(xing)相(xiang)差(cha)顯微鏡圖像(xiang)（10x）。

圖5. 在StemFlex培養基下連續(xu)傳代10次，維持細胞生長速率(lv)和聚集體形態(tai)的(de)一致性(xing)。

（A）累積倍(bei)增比(bi)，以及進行培養基更換、生物反(fan)應器內解離和生物學檢測（包括核型(xing)分(fen)析(xi)和畸(ji)胎瘤形成）的(de)時間線。

（B）在(zai)每次傳代結束時的代表性(xing)相差顯微鏡圖像（10x）

（C-D）分別為在第三次(ci)和第十(shi)次(ci)傳代(dai)結(jie)束時進(jin)行畸胎(tai)瘤(liu)形(xing)成(cheng)的生物學檢測，形(xing)成(cheng)了(le)來(lai)自三個胚層(ceng)的組織，表明體內具有(you)多能性。

（E-F）在第(di)三次(ci)和第(di)十次(ci)傳代結束時還進(jin)行(xing)了G帶(dai)核(he)型(xing)分析。

3.4   使用額外的hiPSC系驗證protocol的穩健性

為了(le)進一(yi)步評估流程的穩健性，額外的商業化hiPSC系TC1133和PLX1在PBS-0.1迷你(ni)生(sheng)物反(fan)應器中使(shi)用StemFlex和mTeSR1培養基進行了(le)三次連續傳代的擴增。

圖6. hiPSC系(xi)TC1133（A）和PLX1（B）在StemFlex和mTeSR1培養(yang)基中進行三次(ci)連續傳代(dai)的生長曲線(xian)。

（C-D）所測(ce)試(shi)的(de)hiPSC系(xi)在StemFlex和(he)mTeSR1中每次傳(chuan)代的(de)累積增長率。

（E）所(suo)測試(shi)的(de)hiPSC系在StemFlex和mTeSR1中的(de)累(lei)積倍(bei)增比。

（F）TC1133和(he)PLX1細胞(bao)團在StemFlex或mTeSR1中培養(yang)，在一(yi)次(ci)傳(chuan)(chuan)代（P1）第5天、二次(ci)傳(chuan)(chuan)代（P2）和(he)三次(ci)傳(chuan)(chuan)代（P3）的代表(biao)性相差顯微鏡圖像（10x）。

（I-J）定量(liang)PCR評估與(yu)多能(neng)性相關(guan)的(de)(de)基因Oct4對于(yu)(yu)TC1133系（G）和PLX1（H），以及(ji)Sox2對于(yu)(yu)相應系。在(zai)靜(jing)態條(tiao)件下培(pei)養的(de)(de)TC1133和PLX1 hiPSCs被用(yong)作對照，以比較在(zai)三次連續傳(chuan)代后(hou)在(zai)生物反應器條(tiao)件下擴增的(de)(de)細胞的(de)(de)相對表(biao)達(da)。

結論

本研究強調(diao)了(le)系統選擇和(he)測試(shi)生(sheng)(sheng)物過(guo)程輸入變(bian)量(liang)（PIVs）的(de)重要(yao)性，并通過(guo)連續傳代創建可(ke)復(fu)制和(he)穩健(jian)的(de)protocol，以實(shi)現臨床和(he)商業PSC生(sheng)(sheng)產。并評估了(le)不同商業化培(pei)養基(ji)的(de)性能(neng)發現StemFlex和(he)mTeSR1培(pei)養基(ji)能(neng)夠有(you)效用于hiPSCs的(de)長期懸浮培(pei)養，這為從小規模和(he)短期PSC protocol向可(ke)predictive的(de)穩健(jian)生(sheng)(sheng)物過(guo)程轉變(bian)奠定(ding)了(le)基(ji)礎。

參考文獻

Robust bioprocess design and evaluation of commercial media for the serial expansion of human induced pluripotent stem cell aggregate cultures in vertical-wheel bioreactors.

注：此篇(pian)文章中(zhong)用到的商業化(hua)培養基種類有限，并(bing)未將其他培養基的測試(shi)結(jie)果(guo)納入(ru)其中(zhong)。如您(nin)想要(yao)在PBS反應器中(zhong)做iPSC擴增或(huo)分化(hua)測試(shi)，可(ke)以聯系曼博生物提供更多的技術支持。