精進細胞轉染工藝：關鍵優化方向及其必要性的探討

細胞轉染(ran)技術(shu)在基因治療和細胞治療開發中扮演(yan)著(zhu)重要角色，為(wei)提高轉染(ran)效率(lv)和病(bing)毒包(bao)裝產量，研究者們往往需要對轉染(ran)工藝中的多個(ge)參數(shu)進行優化（如(ru)下圖(tu)）。

小(xiao)編(bian)(bian)在之(zhi)前分(fen)享(xiang)的中已經(jing)描述了(le)在轉染(ran)過(guo)程(cheng)中對細(xi)胞(bao)培養(yang)基(ji)、細(xi)胞(bao)密度(du)、細(xi)胞(bao)質量等進行優化對細(xi)胞(bao)轉染(ran)過(guo)程(cheng)的重要性，本期小(xiao)編(bian)(bian)會進一(yi)步探討其(qi)它幾個關(guan)鍵優化方向。

一、質粒比例

在進行慢病毒(du)（LV）或腺(xian)相關病毒(du)（AAV）的包(bao)裝時(shi)，質(zhi)(zhi)粒比(bi)例對(dui)確(que)保(bao)轉(zhuan)染過(guo)程中質(zhi)(zhi)粒載體和(he)目標基因的有效傳遞(di)十(shi)分重要。當質(zhi)(zhi)粒比(bi)例不恰當時(shi)可能(neng)導致病毒(du)衣殼蛋白(bai)含(han)量(liang)偏高或導致病毒(du)遺傳物質(zhi)(zhi)含(han)量(liang)偏高，造成虛假(jia)的滴(di)度結果。

與此(ci)同時，通過這種方(fang)式組裝(zhuang)形成(cheng)的病毒活性(xing)粒子數也會下(xia)降，這在(zai)研究者們看來不僅表現出較低的轉染效率，而且會導致空殼(ke)率增加，對(dui)下(xia)游的純化(hua)工藝也隨之造成(cheng)更大的挑戰。

目前對于大多數(shu)比(bi)較成熟(shu)的(de)企(qi)業(ye)而(er)言(yan)(yan)，對項目中的(de)質(zhi)粒比(bi)例的(de)優化是重中之(zhi)重，很多企(qi)業(ye)也(ye)都有自己獨特的(de)參(can)(can)數(shu)；然而(er)，對于很多新(xin)手而(er)言(yan)(yan)，往往不明確(que)某一(yi)特定參(can)(can)數(shu)。這里小編給新(xin)手朋友(you)們一(yi)些建議：對于三質(zhi)粒系統包裝AAV而(er)言(yan)(yan)，可嘗試使用：Ad plasmid：Rep+Cap plasmid：transfer targetd gene= 2：1.5 ：1（圖(tu)1）

圖1 - 不同質粒比例對轉染效率的影響

二、質粒DNA與PEI的比例

質粒DNA與PEI的比率能夠直接影(ying)響DNA與PEI形成的二元(yuan)復合體的穩定性以及(ji)細胞的轉染(ran)效率。

當二(er)者之(zhi)間(jian)的比率過(guo)低時，會導(dao)(dao)致(zhi)二(er)元復合體不夠(gou)穩(wen)定，從而會引發(fa)質(zhi)粒(li)DNA在細胞(bao)(bao)外(wai)脫落、降(jiang)解；與此同時也可(ke)能導(dao)(dao)致(zhi)質(zhi)粒(li)DNA包封不足，質(zhi)粒(li)DNA以(yi)游(you)離的形式存在，導(dao)(dao)致(zhi)轉(zhuan)染效(xiao)(xiao)率不足；反之(zhi)，如果二(er)者比率過(guo)高(gao)，則可(ke)能導(dao)(dao)致(zhi)更(geng)多的PEI相互(hu)結合導(dao)(dao)致(zhi)復合體過(guo)大，難以(yi)被(bei)細胞(bao)(bao)內吞(tun)；再加上(shang)游(you)離的PEI本身對細胞(bao)(bao)也有更(geng)大的細胞(bao)(bao)毒性，影(ying)響細胞(bao)(bao)活力，進而導(dao)(dao)致(zhi)轉(zhuan)染效(xiao)(xiao)率下降(jiang)。

所以(yi)，在進行(xing)病毒包裝(zhuang)(zhuang)時質粒DNA與PEI的(de)比(bi)例也是一大(da)重要(yao)的(de)影響因素。對于初(chu)次(ci)進行(xing)多質粒轉染(ran)進行(xing)病毒包裝(zhuang)(zhuang)的(de)客(ke)戶，小編(bian)建議從PEI與質粒DNA的(de)比(bi)例為(wei)2：1開(kai)始。

圖2 - 不同DNA：PEI比率對轉染效率的影響

三、孵育體積

孵育體積也是影響轉染(ran)效(xiao)率高(gao)低的很重要因(yin)素(su)之(zhi)一(yi)，這主(zhu)要是因(yin)為孵育體積一(yi)方面(mian)影響著質粒(li)DNA與PEI二元(yuan)復合(he)體的形成，另(ling)外一(yi)方面(mian)也影響著二元(yuan)復合(he)體與細胞之(zhi)間的有效(xiao)接觸(chu)。

舉(ju)例來說，如果孵(fu)育(yu)體(ti)積(ji)過小(xiao)，則可能會導致(zhi)局部(bu)濃度過高(gao)，從而影響復(fu)(fu)合(he)物的(de)形成(cheng)(cheng)以及復(fu)(fu)合(he)物的(de)穩定(ding)性(xing)；另一(yi)方面也(ye)會導致(zhi)與細(xi)胞培養基混合(he)后原先孵(fu)育(yu)液中形成(cheng)(cheng)的(de)二(er)元復(fu)(fu)合(he)體(ti)無法充分接觸所有(you)細(xi)胞，導致(zhi)轉(zhuan)(zhuan)染不均勻；反(fan)之如果孵(fu)育(yu)體(ti)積(ji)過大，則一(yi)方面可能降低了(le)(le)二(er)元復(fu)(fu)合(he)體(ti)形成(cheng)(cheng)的(de)可能性(xing)，另一(yi)方面可能也(ye)稀(xi)釋(shi)了(le)(le)二(er)元復(fu)(fu)合(he)體(ti)的(de)濃度，也(ye)會降低二(er)元復(fu)(fu)合(he)體(ti)與細(xi)胞的(de)有(you)效接觸，降低轉(zhuan)(zhuan)染效率。

因此，在包裝過程中小編(bian)建議整體(ti)的(de)孵育體(ti)積(ji)維持在總培養體(ti)積(ji)的(de)5%-10%。

圖3 - 孵育體積與(yu)總(zong)培養體積比對轉染(ran)效(xiao)率的影響(xiang)

四、孵育方式&時間(jian)

在(zai)轉染過(guo)程(cheng)(cheng)中(zhong)，小(xiao)編更推(tui)薦采用AB液(ye)的形式，即(ji)將質粒DNA溶液(ye)與PEI溶液(ye)分(fen)別配(pei)置，然后將PEI溶液(ye)加入(ru)質粒DNA溶液(ye)中(zhong)，注意，在(zai)這(zhe)個過(guo)程(cheng)(cheng)中(zhong)加入(ru)的順(shun)序十(shi)分(fen)重要，否則可能導致形成的質粒DNA與PEI二(er)元復(fu)合體顆粒不(bu)均勻，影響轉染效率。

孵育時間(jian)(jian)(jian)是決定轉(zhuan)(zhuan)染效(xiao)率高(gao)低(di)的(de)另一重要(yao)因素。過短的(de)孵育時間(jian)(jian)(jian)可(ke)能不足以使質(zhi)粒DNA與PEI形(xing)成正(zheng)確大小的(de)二(er)元復合體，降低(di)轉(zhuan)(zhuan)染效(xiao)率；反之如果孵育時間(jian)(jian)(jian)過長(chang)則(ze)可(ke)能導致二(er)元復合體粒徑變大或細胞毒性增加，進而(er)也(ye)導致轉(zhuan)(zhuan)染效(xiao)率降低(di)、細胞死(si)亡率增加。鑒于此(ci)，小編建議在利(li)用PEI轉(zhuan)(zhuan)染多(duo)質(zhi)粒進行病(bing)毒包裝時孵育時間(jian)(jian)(jian)控制在10-20mins區間(jian)(jian)(jian)。

五(wu)、病毒顆粒的(de)收(shou)獲時間(jian)

在進行病(bing)毒(du)包裝時，轉染后病(bing)毒(du)顆(ke)粒的(de)收(shou)獲時間不僅決定(ding)了最終得(de)到的(de)病(bing)毒(du)滴度，而且決定(ding)了病(bing)毒(du)顆(ke)粒的(de)成(cheng)熟度和穩定(ding)性。

當(dang)收獲時(shi)(shi)間過早時(shi)(shi)可(ke)能(neng)(neng)導致(zhi)(zhi)宿主(zhu)細胞還沒有大規模生產病毒粒子，從而(er)導致(zhi)(zhi)病毒滴度偏低且收獲的病毒顆(ke)(ke)粒可(ke)能(neng)(neng)并未(wei)完全組裝(zhuang)或成(cheng)熟(shu)，影(ying)響(xiang)其(qi)感染能(neng)(neng)力；當(dang)收獲時(shi)(shi)間過晚時(shi)(shi)則可(ke)能(neng)(neng)導致(zhi)(zhi)病毒顆(ke)(ke)粒被(bei)降(jiang)解或被(bei)細胞重新(xin)吸收，這也會直接影(ying)響(xiang)到病毒載體的產量和質量，進而(er)影(ying)響(xiang)最終(zhong)基因治療(liao)的效(xiao)果。

所(suo)以在這一因(yin)素(su)下，實驗(yan)者還是需(xu)要對(dui)不同的病(bing)(bing)(bing)毒(du)包(bao)裝時(shi)(shi)間(jian)(jian)進(jin)行測定，以找到(dao)更佳的病(bing)(bing)(bing)毒(du)收獲時(shi)(shi)間(jian)(jian)。針對(dui)于轉(zhuan)染(ran)后(hou)的病(bing)(bing)(bing)毒(du)收集(ji)時(shi)(shi)間(jian)(jian)，小編建議(yi)在包(bao)裝慢病(bing)(bing)(bing)毒(du)時(shi)(shi)可在轉(zhuan)染(ran)后(hou)的48h后(hou)進(jin)行病(bing)(bing)(bing)毒(du)收集(ji)；對(dui)于AAV病(bing)(bing)(bing)毒(du)來說可在轉(zhuan)染(ran)后(hou)的72h后(hou)進(jin)行病(bing)(bing)(bing)毒(du)收集(ji)。

圖4 - 不同病毒顆粒收獲時間對產(chan)量的影響

六、質粒DNA的質量(liang)

除上(shang)述之外，質(zhi)粒DNA的(de)(de)質(zhi)量直接關系到轉染復(fu)合體的(de)(de)形成和穩(wen)定性(xing)。不純的(de)(de)質(zhi)粒DNA由于含有雜(za)質(zhi)，如負電荷的(de)(de)蛋(dan)白質(zhi)或其他分子(zi)，這些雜(za)質(zhi)會干擾(rao)PEI與DNA的(de)(de)結合，降(jiang)低復(fu)合體的(de)(de)形成效率(lv)，甚至產生絮狀沉淀(dian)。這不僅(jin)會降(jiang)低轉染效率(lv)，還可能導(dao)致實驗結果的(de)(de)假陽性(xing)或假陰性(xing)。

綜上，對細(xi)胞轉染(ran)工藝(yi)中的各(ge)個參(can)數(shu)進行優(you)化是提高(gao)實驗(yan)成功率和轉染(ran)效(xiao)率的關鍵(jian)。質粒比例(li)、DNA與(yu)PEI比率、孵育體積(ji)、孵育時間、病毒(du)顆粒收獲時間以及質粒DNA的質量(liang)都是影響轉染(ran)效(xiao)果的重要因素。優(you)化不到位可(ke)能會(hui)導致(zhi)轉染(ran)效(xiao)率低下、實驗(yan)結果不準確(que)等。

因此，對這些參數的(de)嚴(yan)格控制和優化是(shi)實現有效、穩定轉(zhuan)染(ran)的(de)基礎(chu)。如需了解更多(duo)關于(yu)細胞轉(zhuan)染(ran)的(de)優化細節，歡迎聯系上海曼博生物。

參考文獻(xian)

1. Comparison of highly pure rAAV9 vector stocks produced in suspension by PEI transfection or HSV infection reveals striking quantitative and qualitative differences

2. Production of Recombinant Adeno-associated Virus Vectors Using Suspension HEK293 Cells and Continuous Harvest of Vector From the Culture Media for GMP FIX and FLT1 Clinical Vector

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