* 本文來源于公眾號細胞與基因治療領域，作者王勇亮，我司經授權轉載

前言

利用PEI轉染HEK293細胞，生產(chan)AAV病(bing)毒是基因治療行業常用的(de)載體(ti)生產(chan)方式之一。但AAV病(bing)毒生產(chan)成本高昂(ang)，如何(he)實現高病(bing)毒滴度生產(chan)是行業面臨的(de)一項挑戰。

本文將介(jie)紹如何通過(guo)特殊的優(you)化過(guo)程，實現AAV生(sheng)產滴度的倍增。

重組(zu)腺相關病(bing)(bing)毒(du)(du)（rAAV）載體(ti)是基(ji)因治療中(zhong)具有前景的病(bing)(bing)毒(du)(du)載體(ti)之一，目(mu)前，基(ji)于(yu)人胚胎腎293（HEK293）細(xi)胞(bao)(bao)的三質粒轉染是常用的rAAV載體(ti)生產系統，但其(qi)較低的生產效率(lv)成了(le)rAAV基(ji)因治療藥物商(shang)業化道路上(shang)面(mian)臨的挑(tiao)戰(zhan)之一。鑒(jian)于(yu)這一挑(tiao)戰(zhan)，研究人員(yuan)正在致力(li)于(yu)開發其(qi)改進(jin)方法(fa)來提(ti)高rAAV在HEK293細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)的產量。

有研究顯(xian)示，HEK293細(xi)胞(bao)在(zai)進行rAAV等病毒載體生產時，表現出包括內質網（ER）應激(ji)在(zai)內的一些列反(fan)應，ER應激(ji)會激(ji)活(huo)(huo)下游的未(wei)折疊蛋白響應（UPR），以減輕宿主(zhu)細(xi)胞(bao)的壓力，確保細(xi)胞(bao)存活(huo)(huo)并生產病毒載體。

根據(ju)轉錄組(zu)學數據(ju)，研究人員發(fa)現內質網應激上(shang)調時，以下三個基因表達有所增(zeng)強：GADD34/PPP1R15A、熱休克蛋(dan)白(bai)家族成(cheng)員6（HSPA6）和X-框結合蛋(dan)白(bai)1（XBP1）。這些(xie)基因被認為在病毒生成(cheng)過程中發(fa)揮了較為重要的作(zuo)用。

GADD34在(zai)未(wei)折疊(die)蛋白(bai)響應信號(hao)暫時(shi)抑制翻譯后恢(hui)復蛋白(bai)質(zhi)(zhi)合成(cheng)的(de)過程中起著重要作(zuo)用；HSPA6是一個由UPR信號(hao)通過活(huo)(huo)化轉(zhuan)(zhuan)錄因(yin)子(zi)6（ATF6）調控(kong)的(de)內質(zhi)(zhi)網(wang)伴(ban)侶(lv)蛋白(bai)，其表達可以促進內質(zhi)(zhi)網(wang)蛋白(bai)質(zhi)(zhi)的(de)轉(zhuan)(zhuan)運、折疊(die)、分泌及錯誤折疊(die)蛋白(bai)質(zhi)(zhi)的(de)降解(jie)；XBP1的(de)激(ji)活(huo)(huo)也(ye)可以促進內質(zhi)(zhi)網(wang)蛋白(bai)質(zhi)(zhi)的(de)轉(zhuan)(zhuan)運、折疊(die)和分泌。

據此，研究人員假設，這些蛋白(bai)質加(jia)工(gong)基因的(de)過(guo)表達可以減輕因病毒蛋白(bai)質合(he)成引起(qi)的(de)宿主細(xi)胞應激，減少錯誤或未折疊蛋白(bai)質的(de)積累，并且增強病毒的(de)生產。此外(wai)，有研究顯示，使用PEI轉染試劑增強(qiang)抗凋亡基因(yin)BCL2的(de)過(guo)表達能提高HEK293細胞中(zhong)慢病毒載體的(de)產量達53%。上述這些證明了ER蛋白質加工和抗凋亡途徑(jing)在(zai)病毒載體生產中(zhong)的(de)重要作用。

為了(le)提高rAAV載(zai)體(ti)產量，研(yan)究人員(yuan)選定了(le)上述四個(ge)候選基因：XBP1、GADD34/PPP1R15A、HSPA6 和 BCL2，并將這些基因穩定整合到HEK293宿主細胞系的安全(quan)港位點（即(ji)AAVS1位點）實現(xian)其過表達。使用傳統的三(san)質粒瞬時轉(zhuan)染(ran)方法來評估rAAV載(zai)體(ti)的產量和質量。

結果顯示(shi)，在病毒載(zai)體(ti)(ti)高產條件(jian)下，HEK293T細胞過表達XBP1、GADD34、HSPA6和BCL2后，rAAV2載(zai)體(ti)(ti)基因(yin)組滴度和包裝效率有所提(ti)高。其中，rAAV生產量至(zhi)多(duo)提(ti)高了一倍，rAAV載(zai)體(ti)(ti)全衣(yi)殼比(bi)率至(zhi)多(duo)提(ti)高了37%。

而在(zai)(zai)其(qi)低產條件下，上述任(ren)何候選(xuan)基(ji)因的過表(biao)達(da)不會提(ti)高rAAV載體產量(liang)和質量(liang)。研究推測(ce)，在(zai)(zai)高產條件下，更(geng)多(duo)的蛋(dan)白質合成會導致更(geng)多(duo)的病(bing)毒蛋(dan)白在(zai)(zai)ER中積累，從(cong)而增(zeng)加(jia)ER應激。ER蛋(dan)白加(jia)工(gong)基(ji)因的過表(biao)達(da)在(zai)(zai)適應性UPR路徑中發揮更(geng)重要的作用，有(you)助(zhu)于緩解ER應激，進而改善(shan)蛋(dan)白質折疊以備載體包(bao)裝。

此外，過表達組(zu)(zu)的細(xi)胞(bao)生(sheng)長(chang)低于(yu)陰性對照(zhao)組(zu)(zu)，但觀察(cha)到(dao)了較大的生(sheng)產(chan)率(lv)提升（約一倍(bei)），穩(wen)定(ding)整合這些ER蛋(dan)白加(jia)工基因(yin)后，穩(wen)轉基因(yin)的持(chi)續(xu)表達會消耗營養和能(neng)(neng)量，減緩總(zong)體(ti)細(xi)胞(bao)生(sheng)長(chang)。同時，增(zeng)強的病毒包裝過程消耗額(e)外的營養與能(neng)(neng)量，這可能(neng)(neng)是細(xi)胞(bao)生(sheng)長(chang)表現不(bu)佳(jia)的原因(yin)。

研究還指出，使用PEI轉染試劑增強ER蛋白加工基(ji)因的(de)過(guo)表達對(dui)提高rAAV的(de)生產(chan)具有(you)重(zhong)要意(yi)義，未來，通(tong)過(guo)ER加工基(ji)因的(de)各種過(guo)表達組合可能會更好地提高病毒載體(ti)生產(chan)率和整體(ti)產(chan)品質量。

本(ben)研究中所觀察到的病毒載(zai)體基因組滴度的提高得(de)益于細(xi)胞(bao)內(nei)蛋白(bai)質生(sheng)成的改善、病(bing)毒載(zai)體衣(yi)殼質量和(he)病(bing)毒載(zai)體包裝(zhuang)效率的提高。此外，這一生(sheng)產能力(li)的提高在不(bu)(bu)同的HEK293細(xi)胞(bao)系和(he)各種AAV血(xue)清型(xing)（AAV2和(he)8）中得(de)到了驗證，盡管其提高的程(cheng)度略有不(bu)(bu)同。

這些發現進一步驗證了從組學研究中識別出(chu)的(de)分(fen)子層面的(de)數據(ju)特征的(de)價值，并表明(ming)細胞系改造工程可以作為一種有希望的(de)策略(lve)來(lai)增強包括rAAV在內的(de)病(bing)毒載體產量(liang)和質(zhi)量(liang)。

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