使用熱穩定的FGF-2（bFGF）和無動物源的TGF-β1，改進集落均一性的Weekend-free iPSC培養

01   概覽

無飼養(yang)層（Feeder-free）的人誘導(dao)多能(neng)干細胞（iPSCs）培養(yang)是(shi)一個高(gao)度重復(fu)且常規的過(guo)程，但由于培養(yang)基的投入以(yi)及需(xu)要頻繁更換培養(yang)基，可能(neng)會導(dao)致成(cheng)本(ben)高(gao)昂。

培(pei)養基的額(e)外成(cheng)本主(zhu)要基于(yu)兩個(ge)核心細胞間(jian)通訊(xun)生長因(yin)子(zi)的需(xu)求，即(ji)成(cheng)纖維(wei)(wei)細胞生長因(yin)子(zi)2（FGF-2）和轉化生長因(yin)子(zi)B1（TGF-B1），它們需(xu)要在(zai)精確濃度下存在(zai)以維(wei)(wei)持(chi)iPSCs的干性(xing)/多能性(xing)。然而，要在(zai)體外環境中實現這一(yi)點具(ju)有(you)挑戰(zhan)性(xing)，主(zhu)要是由于(yu)FGF-2的快速降解，其有(you)效(xiao)半(ban)衰期(qi)小于(yu)10小時，導(dao)致需(xu)要每天更換(huan)培(pei)養基。

在本應用說明中，我們描述了一種使用包含Qkine熱穩定FGF2-G3（Qk053）和TGF-B1 PLUS（QK010）生長因子的E8樣培養基來維持、培養和測試iPSCs多能性的方法。該過程展示了在不需要每日更換培養基的情況下對iPSCs進行維持、擴增和多能性評估，實現了無需周末維護（Weekend-free）的培養和擴增，同時保持了細胞的多能性和增殖潛力。

02   引言

人(ren)誘(you)導多能干細胞(bao)（iPSCs）是一種(zhong)(zhong)體外模型(xing)，功能上(shang)是永生的，能夠(gou)在保持(chi)分化為(wei)任何體細胞(bao)類型(xing)的能力的同(tong)時(shi)，進行(xing)增(zeng)殖。由于iPSCs可(ke)以(yi)應用于各種(zhong)(zhong)研究領域(yu)，并(bing)且不像胚胎干細胞(bao)那(nei)樣面(mian)臨相同(tong)的倫理問題，人(ren)們(men)對iPSCs的生成興趣(qu)有所增(zeng)加。

這就產生了培養大量單個iPSC系或各種不同iPSC系的需求，這增加了日常更換培養基的成本且耗時。這一需求推動了對細胞培養基中主要信號成分的識別工作，以有效培養iPSCs。FGF-2通過與FGFR1/FGFR4結合，激活PI3K/AKT/mTOR通路，而TGF-β1通過與TGFBR1/2結合，激活TGF-β通路，這兩者被強調為這些核心信號成分中的重要組成部分。

在日(ri)常維護中保持多能性對于以敏感性著稱的(de)細胞培養如iPSCs來(lai)說是一項挑戰。使用(yong)高純度(du)和熱穩(wen)定的(de)生長(chang)(chang)因(yin)(yin)子(zi)可以幫助(zhu)降低這種風(feng)險，因(yin)(yin)為它(ta)們缺乏內毒素等雜質(zhi)，減少了(le)對基因(yin)(yin)穩(wen)定性的(de)影(ying)響，并提供(gong)了(le)更為一致(zhi)的(de)必要生長(chang)(chang)因(yin)(yin)子(zi)方案(an)。

E8樣培(pei)(pei)養(yang)基(ji)是一種(zhong)化(hua)(hua)學定義的(de)培(pei)(pei)養(yang)基(ji)，這意味著它包含(han)的(de)未(wei)定義成分比其他復雜(za)培(pei)(pei)養(yang)基(ji)少(shao)，減少(shao)了(le)變異性(xing)(xing)，并(bing)提高了(le)個體iPSC系(xi)或各種(zhong)不同(tong)iPSC系(xi)培(pei)(pei)養(yang)之間的(de)可重復性(xing)(xing)。這種(zhong)配方已(yi)經過(guo)優化(hua)(hua)，可以支持(chi)(chi)細胞(bao)的(de)強(qiang)勁(jing)增殖，同(tong)時確保iPSC的(de)多(duo)能性(xing)(xing)保持(chi)(chi)不變，從而(er)提高細胞(bao)產量(liang)并(bing)使(shi)培(pei)(pei)養(yang)的(de)擴展(zhan)更加一致。iPSCs的(de)多(duo)能性(xing)(xing)可以通過(guo)檢測細胞(bao)內(nei)表面標志物(wu)如NANOG、SOX2和OCT-4來評估(gu)。

03   材料與方法

iPSC常(chang)規(gui)培養工作流程示意圖（圖1）概述了(le)每日維持iPSC的(de)(de)步驟，并(bing)展示了(le)與(yu)使用標準協議的(de)(de)區別(bie)。多能性評估時間(jian)表(biao)突出顯示了(le)測(ce)試iPSC多能性保持情(qing)況的(de)(de)重(zhong)要時間(jian)點(dian)（圖2）。

圖1：iPSC的每周例行維(wei)護(hu)時(shi)間表

圖2：多能性評估測試時(shi)間(jian)表

04   細胞培養和維護

iPSC每周傳(chuan)(chuan)代兩(liang)次，使用(yong)0.5mM EDTA進(jin)行細胞(bao)脫離，并以1:6的(de)分裂比率接(jie)種在涂有vitronectin（5μg/ml）的(de)6孔板中(zhong)，使用(yong)E8樣培(pei)養基(ji)進(jin)行培(pei)養（見表1）。傳(chuan)(chuan)代后的(de)第二天，移除已用(yong)培(pei)養基(ji)，并更換為5ml的(de)新(xin)鮮培(pei)養基(ji)。

表1:E8樣(yang)培養基(ji)構建組件

添(tian)加的(de)各組(zu)分(fen)使用前(qian)需(xu)進行(xing)無菌和過濾消(xiao)毒

05   免疫細胞化學（ICC）

iPSC使用Accutase進行細胞脫離，以每孔(kong)500個細胞的(de)密(mi)度接(jie)種在涂(tu)有vitronectin（5μg/ml）的(de)96孔(kong)板中(zhong)，并在含有ROCK抑制劑（Y-27632，10μM）的(de)E8樣培(pei)(pei)養基中(zhong)培(pei)(pei)養。接(jie)種后(hou)的(de)第二天，移除ROCK抑制劑，每孔(kong)加(jia)入200μl E8樣培(pei)(pei)養基。

3天后，用(yong)4%多(duo)聚甲醛固定細胞(bao)，并(bing)使用(yong)稀(xi)釋在0.1% Triton X-100中的10%驢血清（donkey serum）進行封閉和(he)透化。然后使用(yong)特異性(xing)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)針對多(duo)能性(xing)標志物（OCT-4、NANOG和(he)SOX2）在4°C下(xia)過夜免疫染色。隨后，洗(xi)滌iPSC，并(bing)與二抗(kang)(kang)(kang)驢抗(kang)(kang)(kang)小鼠AlexaFluor 647或驢抗(kang)(kang)(kang)山羊(yang)（Donkey anti-Goat）AlexaFluor488和(he)Hoechst 33258一起(qi)孵(fu)育，然后在磷酸鹽(yan)緩沖鹽(yan)水（PBS）中成像。使用(yong)EVOS M5000系統(tong)獲取明場和(he)熒(ying)光圖像。

06   結果

FGF2-G3和(he)TGF-β1 PLUS能夠維持iPSC的多能性(xing)、形態外(wai)觀和(he)標記物表達。

在包含Qkine FGF2-G3和TGF-β1 PLUS生長因子的E8樣培養基中培養了一個月的iPSC，始終表現出高密度而沒有自發分化。明場成像顯示了在整個時間段內保持良好的細胞形態，具有清晰的邊緣和緊湊的細胞，形成完整的圓形菌落（見圖3）。這些iPSC通過高水平表達多能性標志物NANOG、SOX2和OCT-4，保持了它們的多能潛力，如圖4所示。

圖3：在E8樣培養基(ji)中培養的(de)細胞群體高度(du)保持的(de)形態外觀成像(xiang)

(A) 經(jing)過(guo)2次(ci)傳代和7天培養(yang)后(hou)的成像

(B) 經過4次(ci)傳代和14天(tian)培養后(hou)的成(cheng)像

(C)經過(guo)8次傳代和(he)28天培養后的成像（比例尺=300μm）

圖4：在E8樣培(pei)養基中培(pei)養的(de)(de)iPSC的(de)(de)多(duo)能性標志物的(de)(de)免疫細胞(bao)化學（ICC）成像

(A) 明(ming)場(chang)圖像(xiang)

(B) NANOG表(biao)達（綠(lv)色）

(C) OCT-4表達（紅(hong)色）

(D) NANOG、OCT-4和Hoechst 33258的組合(he)成像

(E) 染色(se)菌落的明場圖像

(F) SOX2表達(da)（綠色）

(G) SOX2和Hoechst 33258的組合成像（藍色），比例(li)尺=150μm

07   結論

iPSC在臨床(chuang)和(he)研究領域的重要(yao)性日益(yi)增加，因為(wei)它們有潛(qian)力分(fen)化為(wei)人體(ti)內所有體(ti)細胞類型。成功(gong)的分(fen)化依(yi)賴于在培(pei)養(yang)過程中(zhong)保持iPSC的多(duo)能性，因此需(xu)要(yao)使用正確的培(pei)養(yang)基。

本文展示的數據表明，在E8樣培養基中使用Qkine FGF2-G3和TGF-B1 PLUS熱穩定生長因子能夠保持iPSC的多能性，支持其增殖，同時避免了每日更換培養基的需求。

這些(xie)iPSC隨后被分化為各種胚層和細胞類型，進一步表明(ming)在結合Qkine的生長因子的無周末(mo)(Weekend-free )更換培養基(ji)條(tiao)件下，其多能性得到了保持。

與在E8型培(pei)養(yang)(yang)基(ji)中培(pei)養(yang)(yang)的(de)(de)iPSC相比，雖然觀察到類(lei)似的(de)(de)增(zeng)殖率，但自(zi)發(fa)分化的(de)(de)水平(ping)較高，降低了用于未來(lai)工作的(de)(de)iPSC集落的(de)(de)質量。這些細胞(bao)還(huan)需要(yao)每(mei)日更換(huan)培(pei)養(yang)(yang)基(ji)，導致(zhi)維(wei)護(hu)培(pei)養(yang)(yang)物的(de)(de)成本(ben)和時間投入增(zeng)加（數據可根據要(yao)求提供，后續也(ye)會發(fa)布新(xin)推文）。

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