誘導性多能干細胞（iPSC）分化為中胚層

iPSC向三胚層分化系(xi)列,將分別介紹(shao)誘導多能干細胞（iPSCs）分化為外胚(pei)層（點擊查看）、中(zhong)胚層和(he)內(nei)胚層譜系過程(cheng)的(de)Protocol，本(ben)期將(jiang)重點討論將(jiang) iPSC 分化為中(zhong)胚層細胞的(de)Protocol。

無(wu)飼養層(ceng)(ceng)人類誘導性多能干細(xi)胞 (iPSC) 分化為中胚(pei)層(ceng)(ceng)細(xi)胞是一個(ge)復雜的過程，需(xu)要(yao)使(shi)用(yong)諸如激(ji)(ji)活素(su) A、BMP4和FGF2等生長因子(zi)。此(ci)外，還需(xu)要(yao) CHIR99021 和磷脂酰肌醇(chun) 3-激(ji)(ji)酶 (PI3-激(ji)(ji)酶) 抑制劑(ji) LY294002 等因子(zi)來提(ti)高分化效(xiao)率并穩定中胚(pei)層(ceng)(ceng)命運(yun)。這(zhe)種組合使(shi)研究人員能夠(gou)可靠地生成功(gong)能性中胚(pei)層(ceng)(ceng)細(xi)胞，用(yong)于(yu)各(ge)種生物醫學(xue)應用(yong)。

在本應用說明中，我們概述了使用含有重組 FGF2 家族成員（如 Qkine FGF2-G3 (Qk053)）以及激活素 A (Qk001) 和 BMP-4 (Qk038) 生(sheng)長因子的(de)培養基將 iPSC 分化(hua)為中胚層細(xi)胞的(de)方法。中胚層標記物(wu)表達用于通過免疫細(xi)胞化(hua)學評估成功分化(hua)。

01   介紹

人類誘導多(duo)能干細(xi)(xi)胞(bao) (iPSC) 是一(yi)種體外(wai)(wai)模(mo)型，代表(biao)了再生(sheng)醫學(xue)(xue)和細(xi)(xi)胞(bao)生(sheng)物(wu)學(xue)(xue)的關鍵突(tu)破。iPSC 是通過引(yin)入特定轉錄(lu)因子將成年體細(xi)(xi)胞(bao)重新(xin)編程為多(duo)能狀態而產(chan)生(sheng)的。重新(xin)編程 iPSC 使這(zhe)些細(xi)(xi)胞(bao)能夠(gou)分化為三(san)個胚(pei)(pei)層(ceng)中的任何細(xi)(xi)胞(bao)類型：外(wai)(wai)胚(pei)(pei)層(ceng)、中胚(pei)(pei)層(ceng)和內(nei)胚(pei)(pei)層(ceng)。這(zhe)為疾病建模(mo)、藥物(wu)發現和細(xi)(xi)胞(bao)療法(fa)提(ti)供(gong)了無與(yu)倫比的潛(qian)力，而所(suo)有這(zhe)些都沒有使用胚(pei)(pei)胎干細(xi)(xi)胞(bao)所(suo)帶來的倫理問題[1]。

鑒(jian)于中(zhong)胚(pei)層在生(sheng)成(cheng)各(ge)種重要組(zu)織和器官（包括心臟、血液、肌肉和骨骼）方面(mian)發揮的作用[2]，將 iPSC 分化(hua)為(wei)中(zhong)胚(pei)層細胞系尤為(wei)重要。

iPSC 分(fen)化為中胚層(ceng)細胞的(de)(de)過程通常涉及在體外模擬胚胎(tai)發(fa)育(yu)階段(duan)。在胚胎(tai)發(fa)生過程中，中胚層(ceng)的(de)(de)形成(cheng)由一系列信號通路(lu)啟動，包括 nodal、Wnt 和(he)骨(gu)形態發(fa)生蛋白 (BMP)，這(zhe)些信號通路(lu)對于中胚層(ceng)特化和(he)隨后(hou)的(de)(de)中胚層(ceng)發(fa)育(yu)至關重要[3]。為了在受(shou)控的(de)(de)實驗室環境中模擬這(zhe)些條件，研究人員利(li)用特定(ding)的(de)(de)生長因子和(he)小分(fen)子通過類似的(de)(de)發(fa)育(yu)信號來引導iPSC。

iPSC 成功分(fen)(fen)化(hua)為中胚層細(xi)胞并(bing)非(fei)沒有挑戰(zhan)。由于 iPSC 系內存在差(cha)異，分(fen)(fen)化(hua)效率(lv)以及(ji)不完全或混合譜(pu)系分(fen)(fen)化(hua)的可能性(xing)是研究人員繼續解決的重(zhong)大障礙。可以通過(guo)研究轉錄因子(zi)標(biao)記（如 brachyury 和(he) MIXL1）的表達(da)來評估成功率(lv)[4]。

02   材料(liao)和方法

1.細胞培養和維護

每(mei)周使(shi)用(yong)(yong) 0.5 mM EDTA 傳(chuan)代(dai)兩次 iPSC 以分(fen)離，然后以 1:6 的(de)分(fen)流比接種(zhong)在玻璃粘連蛋白vitronectin ( Qkine，Qk120 ) (5 μg/ml) 包(bao)被的(de) 6 孔板中(zhong)，并在 E8 類(lei)培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)基(ji)中(zhong)培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)。傳(chuan)代(dai)后的(de)第二天，去除用(yong)(yong)過的(de)培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)基(ji)，用(yong)(yong) 5 ml E8 類(lei)培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)基(ji)替換，使(shi)細(xi)胞遵循周/末無培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)基(ji)更換模式。有關(guan)此過程的(de)更多信息，請(qing)，使用 Qkine 的耐熱 FGF-2 (bFGF) 以及我們的無(wu)動物(wu)來源 TGF-β1 和玻璃粘連(lian)蛋白vitronectin進行weekend-free 的iPSC培養，以提高菌落(luo)同質性。

2.iPSC 分(fen)化為中胚層(ceng)

中胚層分(fen)化(hua)工(gong)作流程示(shi)意圖（圖 1）概述了 iPSC 分(fen)化(hua)為中胚層的步驟以及(ji)通過測試(shi)中胚層表達標記來評估分(fen)化(hua)的步驟。

圖1.中胚層分化和評估測試時(shi)間表

使用 Accutase 分離 iPSC ，并以 1,000 個細胞/孔(kong)的密(mi)度接種在(zai)涂有 vitronectin ( Qk120 ) (5 μg/ml) 的(de) 96 孔(kong)板中，該板中的(de) E8 類培(pei)養(yang)(yang)基含有 ROCK 抑(yi)制劑 (Y-27632, 10 μM)。第二天(tian)(tian)，即第 1 天(tian)(tian)，用新鮮制備的(de)中胚層培(pei)養(yang)(yang)基喂養(yang)(yang)細(xi)胞（表 1）。第 2 天(tian)(tian)和(he)第 3 天(tian)(tian)更換培(pei)養(yang)(yang)基，使用新鮮制備的(de)中胚層培(pei)養(yang)(yang)基。

表(biao)1.日常(chang)中胚層培養(yang)基(ji)配制(zhi)成分，各成分在(zai)使用前(qian)無菌添加

表2.CDM-PVA培養基配(pei)制成(cheng)分，各(ge)成(cheng)分無(wu)菌添加，并(bing)在使用前(qian)過濾培養基

3.免(mian)疫細胞化學

在第(di)4天，細胞(bao)用4%多(duo)聚甲醛固定，并(bing)用10%驢血清（稀釋在0.1% Triton X-100中）進(jin)行(xing)封(feng)閉和透化。

針對中(zhong)胚層(ceng)標志物brachyury和MIXL1的特異性(xing)抗(kang)體被(bei)用于免(mian)疫染色，并在4°C下孵育過夜。然后(hou)，將iPSCs洗滌后(hou)與二抗(kang)（ Donkey anti-Goat AlexaFluor 488 或Donkey anti-Rabbit AlexaFluor 488）和Hoechst 33258孵育，最終在磷酸鹽緩沖液中(zhong)進行成像。

圖(tu)2. 分化(hua) iPSC 中(zhong)中(zhong)胚層標志物(wu)的(de)免疫細(xi)胞化(hua)學。轉錄因子(zi) Brachyury [綠色(se)，A]、Hoechst 33258 [藍(lan)色(se)，B]、Brachyury 和 Hoechst 的(de)組合 [C] 和轉錄因子(zi) MIXL1 [綠色(se)，D]、Hoechst33258 [藍(lan)色(se)，E]、MIXL1 和 Hoechst 的(de)組合 [F]。圖(tu)像是使用 EVOS M5000 獲取的(de)（比例尺 = 150 μm）。

03   結論

將 iPSC 分化為中胚層(ceng)(ceng)細(xi)胞是一個不(bu)斷發(fa)(fa)展(zhan)但前景廣闊的(de)(de)領域(yu)，具有巨(ju)大(da)的(de)(de)治療潛(qian)力。通過利用(yong)(yong)我(wo)們對胚胎(tai)發(fa)(fa)育的(de)(de)理解并改進分化方(fang)案，研究人員可以(yi)可靠地生成(cheng)功能性(xing)中胚層(ceng)(ceng)細(xi)胞，用(yong)(yong)于(yu)生物醫學應用(yong)(yong)。

本應(ying)用(yong)說明中提供的數(shu)據表(biao)明，使用(yong) Qkine FGF2-G3(Qk053)、Qkine activin A(Qk001) 和 BMP-4 (Qk038) 支持 iPSC 分化為中胚層細胞。

參考(kao)文(wen)獻

[1] Varum, S. et al. Energy Metabolism in Human pluripotent stem cells and their differentiated counterparts. PLoS ONE. 2011;6(6):e20914. doi: 10.1371/journal.pone.0020914

[2] Loh, K. M. et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell, 2016 Jul 14;166(2):451-467. doi: 10.1016/j.cell.2016.06.011

[3] Loh, K. M. et al. Generating Cellular Diversity and Spatial Form: Wnt Signaling and the Evolution of Multicellular Animals. Developmental Cell, 2016 Sep 26;38(6):643-55. doi: 10.1016/j.devcel.2016.08.011.

[4] Lam, A. Q. et al. Rapid and Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Intermediate Mesoderm That Forms Tubules Expressing Kidney Proximal Tubular Markers. Journal of the American Society of Nephrology, 2014 Jun; 25(6): 1211–1225. doi: 10.1681/ASN.2013080831

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