誘導性多能干細胞 (iPSC) 分化為(wei)內(nei)胚(pei)層(ceng)

iPSC向三(san)胚(pei)(pei)(pei)層(ceng)分(fen)化(hua)系列,將分(fen)別介紹誘(you)導多能干細胞(bao)（iPSCs）分(fen)化(hua)為外胚(pei)(pei)(pei)層(ceng)、中胚(pei)(pei)(pei)層(ceng)和內(nei)胚(pei)(pei)(pei)層(ceng)譜(pu)系過程的(de)Protocol，本期將重點討(tao)論將 iPSC 分(fen)化(hua)為內(nei)胚(pei)(pei)(pei)層(ceng)細胞(bao)的(de)Protocol。

無飼養層(ceng)(ceng)人(ren)類誘導(dao)性(xing)多能干細胞 (iPSC) 分化為內胚層(ceng)(ceng)細胞是(shi)一個復雜的過程，涉及(ji)促活素(su) A、BMP4和(he)FGF2等(deng)生長因(yin)(yin)子(zi)。此外，還需要 CHIR99021 和(he)磷脂酰肌(ji)醇 3-激(ji)酶 (PI3-激(ji)酶) 抑制劑 LY294002 等(deng)因(yin)(yin)子(zi)來提(ti)高(gao)分化效率并穩定(ding)內胚層(ceng)(ceng)命運。這種組合使研究人(ren)員能夠(gou)可靠地生成功能性(xing)定(ding)形(xing)內胚層(ceng)(ceng) (DE) 細胞，用于各種生物醫學應用。

在本應用說明中，我們概述了使用含有重組 FGF2 家族成員（如 Qkine FGF2-G3 (Qk053)）以及激活素 A (Qk001) 和 BMP-4 (Qk038) 生長因子的培養基將 iPSC 分化為定形內胚層 (DE) 細胞的方法。DE 標記表達用于通過免疫細胞化學評估成功分化。

01   介紹

人類誘導多能干(gan)細(xi)胞 (iPSC) 是一種體外(wai)模(mo)型，代表(biao)了再生醫學和(he)細(xi)胞生物學的關鍵突破(po)。iPSC 是通(tong)過引入特定轉錄因子將成體體細(xi)胞重編(bian)程(cheng)為(wei)多能狀態(tai)而產生的。重編(bian)程(cheng) iPSC 使(shi)這些(xie)細(xi)胞能夠分(fen)化為(wei)三個胚(pei)層(ceng)中的任何細(xi)胞類型：外(wai)胚(pei)層(ceng)、中胚(pei)層(ceng)和(he)內胚(pei)層(ceng)。這為(wei)疾病建模(mo)、藥物發現(xian)和(he)細(xi)胞療法提(ti)供(gong)了較大潛力，而這些(xie)都沒有使(shi)用胚(pei)胎干(gan)細(xi)胞所帶來的倫理問題[1]。

將 iPSC 分化為(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)胚(pei)層譜系細胞尤(you)為(wei)(wei)(wei)重(zhong)要(yao)，因為(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)胚(pei)層衍生(sheng)物在(zai)人體生(sheng)理學中(zhong)發揮著(zhu)重(zhong)要(yao)作用。內(nei)(nei)胚(pei)層形(xing)成(cheng)肝臟(zang)、胰腺、肺和(he)胃(wei)腸道(dao)內(nei)(nei)壁等重(zhong)要(yao)器官(guan)[2]。了解 iPSC 分化為(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)胚(pei)層細胞的(de)過(guo)程(cheng)，為(wei)(wei)(wei)開發多種疾(ji)病（包括(kuo)肝病、糖尿(niao)病和(he)囊性(xing)纖(xian)維(wei)化）的(de)治療方法，以(yi)及為(wei)(wei)(wei)研究和(he)移(yi)植目的(de)生(sheng)成(cheng)類器官(guan)提供了希(xi)望。

iPSC 分化為內胚(pei)層細胞的過程(cheng)通常涉及在(zai)體外模擬(ni)胚(pei)胎(tai)發育階段。在(zai)胚(pei)胎(tai)發生過程(cheng)中，內胚(pei)層形成由(you)一系列信號(hao)通路(lu)啟動(dong)，包(bao)括 nodal、Wnt 和(he) activin/nodal，這(zhe)些通路(lu)對于中內胚(pei)層特(te)化和(he)隨后的 DE 發育很重要[3,4]。為了在(zai)受(shou)控的實驗室環境中模擬(ni)這(zhe)些條件，研(yan)究人員(yuan)利用特(te)定的生長因子(zi)和(he)小分子(zi)通過類(lei)似(si)的發育信號(hao)來引導iPSC。

iPSC 成(cheng)功分化為內胚層細胞也面臨諸多挑(tiao)戰。iPSC 系內的(de)變異(yi)性(xing)、分化效率(lv)以及不完全或混合譜(pu)系分化的(de)可能性(xing)是研究人(ren)員不斷克服的(de)較大障礙。評估成(cheng)功與否(fou)需要檢查(cha) SRY-box 轉錄因子 17 (SOX17) 和轉錄因子 GATA4 等(deng)標記(ji)物的(de)表達[5]。

02   材料和方法

1.細胞培養(yang)和維護

每周使用 0.5 mM EDTA 傳代兩次 iPSC 以分離，然后以 1:6 的分流比接種在玻璃粘連蛋白vitronectin ( Qkine，Qk120 ) (5 μg/ml) 包被的 6 孔板中，并在 E8 類培養基中培養。傳代后的第二天，去除用過的培養基，用 5 ml E8 類培養基替換，使細胞遵循周末無培養基更換模式。使用 Qkine 的耐熱 FGF-2 (bFGF) 以及我們的無動物來源 TGF-β1 和玻璃粘連蛋白vitronectin進行weekend-free 的iPSC培養，以提高菌落同質性。

2.iPSC 分化為定(ding)形內(nei)胚層（DE）

DE 分(fen)化(hua)(hua)工作(zuo)流程示圖(tu)（圖(tu) 1）概(gai)述(shu)了將 iPSC 分(fen)化(hua)(hua)為 DE 以及通過測(ce)試 DE 表達標記來評估分(fen)化(hua)(hua)的步驟(zou)。

圖(tu)1.內胚層(ceng)分(fen)化和評估測(ce)試時間表

使用 Accutase 分離 iPSC ，并以 1,000 個細胞/孔的密度接種在涂有 vitronectin ( Qk120 ) (5 μg/ml) 的 96 孔板中，該板中的 E8 類培養基含有 ROCK 抑制劑 (Y-27632, 10 μM)。第二天，即第 1 天，用新鮮制備的 DE 1 培養基喂養細胞（表 1）。第 2 天，用新鮮制備的 DE 2 培養基喂養細胞（表 1），第 3 天，用新鮮制備的 DE 3 培養基喂養細胞（表 1）。

表1.日常DE培(pei)養基配制成分，各成分在(zai)使(shi)用前無菌(jun)添加

表2.CDM-PVA培(pei)養(yang)基配制成分，各成分無菌添加，并(bing)在使用前過濾培(pei)養(yang)基

3.免疫細胞(bao)化學

第4天，細胞用(yong)4%多聚甲醛固(gu)定，隨后(hou)用(yong)稀(xi)釋(shi)在(zai)0.1% Triton X-100中的(de)(de)10%驢血清進(jin)行(xing)(xing)封閉和透化。針對內胚層標(biao)志物GATA4和SOX17的(de)(de)特異性(xing)抗體被用(yong)于在(zai)4°C下過夜免疫染色。然后(hou)將iPSCs（誘導多能干細胞）洗滌，并與二(er)抗（ Donkey anti-Goat AlexaFluor 488 或Donkey anti-Rabbit AlexaFluor 488）和Hoechst 33258共同孵(fu)育(yu)，最后(hou)在(zai)磷(lin)酸(suan)鹽緩沖(chong)液中進(jin)行(xing)(xing)成像。 

圖(tu)2. 分化(hua) iPSC 中內胚層(ceng)標志物(wu)的免疫細胞(bao)化(hua)學(xue)。SRY框轉(zhuan)錄因子(zi)17（SOX17）[綠色，A]，Hoechst 33258 [藍色，B]，SOX17和(he)Hoechst結合圖(tu)像(xiang)[C]，以及轉(zhuan)錄因子(zi)GATA4 [綠色，D]，Hoechst 33258 [藍色，E]，GATA4和(he)Hoechst結合圖(tu)像(xiang)[F]。這些圖(tu)像(xiang)是在(zai)10倍放大倍率下，使(shi)用Zeiss LSM 980配備的Airyscan2的拼接(jie)功(gong)能(neng)獲取的。

03   結論

將 iPSC 分化(hua)為 DE 細胞是一個發(fa)展(zhan)迅速且前景廣闊的(de)(de)領(ling)域，具有巨大的(de)(de)治療潛力(li)。通過利用(yong)我們對胚胎發(fa)育(yu)的(de)(de)理(li)解并改進分化(hua)方案(an)，研究人員可(ke)以可(ke)靠地生成功能(neng)性 DE 細胞，用(yong)于(yu)各種生物醫學應(ying)用(yong)。

本應用說明中提供的數據(ju)表明，使用 Qkine FGF2-G3(Qk053)、Qkine activin A(Qk001) 和 BMP-4 (Qk038) 支(zhi)持 iPSC 分化為 DE 細胞。

參考文獻

[1] Varum, S. et al. Energy Metabolism in Human pluripotent stem cells and their differentiated counterparts. PLoS ONE. 2011;6(6):e20914. doi: 10.1371/journal.pone.0020914

[2] Zorn, A. M. et al. Vertebrate Endoderm Development and Organ Formation. Annual review of cell and development biology 2009:25:221-51. doi: 10.1146/annurev.cellbio.042308.113344

[3] Fang, Y. et al. Metabolic and Epigenetic Regulation of Endoderm Differentiation. Trends in Cell biology 2022 Feb;32(2):151-164. doi: 10.1016/j.tcb.2021.09.002

[4] Ikonomou, L. et al. Derivation of endodermal progenitors from pluripotent stem cells. Journal of Cellular Physiology. 2015 Feb;230(2):246-58 doi: 10.1002/jcp.24771

[5] McLean, A. B. et al. Activin A Efficiently Specifies Definitive Endoderm from Human Embryonic Stem Cells Only When Phosphatidylinositol 3-Kinase Signaling Is Suppressed. Stem Cells. Jan;25(1):29-38. doi: 10.1634/stemcells.2006-0219

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