良好(hao)生產規范(fan)(GMP)的(de)基本原則中曾對于使用(yong)無(wu)菌(jun)(jun)封閉(bi)(bi)系(xi)(xi)(xi)統進行細(xi)胞治療產品(pin)的(de)加工、儲存(cun)和轉移有(you)一系(xi)(xi)(xi)列建議，而(er)低(di)(di)(di)溫保(bao)存(cun)（-80℃--196℃）是細(xi)胞轉移比較有(you)效(xiao)的(de)方法。下文將評(ping)估一種新(xin)的(de)封閉(bi)(bi)系(xi)(xi)(xi)統無(wu)菌(jun)(jun)凍(dong)存(cun)管(guan)設備-美國Sexton品(pin)牌CellSeal無(wu)菌(jun)(jun)冷凍(dong)凍(dong)存(cun)管(guan)（下圖）在低(di)(di)(di)溫冷凍(dong)存(cun)儲條件下用(yong)于保(bao)證細(xi)胞治療產品(pin)的(de)安全低(di)(di)(di)溫保(bao)存(cun)和存(cun)儲的(de)性能。

圖-美國Sexton品牌CellSeal無菌(jun)冷凍凍存管

美國Sexton品(pin)牌CellSeal無菌冷凍凍存管的主要特點：

?  CellSeal用途：

-細胞制劑的藥(yao)(yao)包材容(rong)器（直接接觸藥(yao)(yao)品的包裝(zhuang)容(rong)器）

?  CellSeal結(jie)構(gou)設計：

CellSeal無菌凍(dong)存(cun)管精密設計，結(jie)合了凍(dong)存(cun)袋和硬瓶的優(you)點，滿足細胞治療行(xing)業需求

?  CellSeal選材考(kao)究(jiu)：

美(mei)國(guo)藥典高等級(ji)的醫用塑料USP Class VI，選材(cai)考究，耐低溫、耐DMSO、抗斷裂

?  CellSeal藥包材測(ce)試清單齊全(quan)：

批(pi)次放行測(ce)試清單、設計(ji)測(ce)試項目清單以及其他凍存管(guan)制(zhi)造過程(cheng)控(kong)制(zhi)等清單

?  CellSeal世界范圍內已有豐富的IND和BLA案例：

十幾個(ge)(ge)國家40多種IND藥(yao)物(wu)，2個(ge)(ge)上市藥(yao)物(wu)（中(zhong)國及(ji)美國）

Sexton品(pin)牌CellSeal和Corning凍(dong)存管比較

CellSeal和(he)Corning凍(dong)存管中(zhong)的細(xi)胞(bao)當使用10% DMSO的冷凍(dong)保(bao)護劑CPA時(shi)，細(xi)胞(bao)在-85℃冰(bing)箱中(zhong)(a)和(he)37℃水浴(B)中(zhong)變化(hua)的溫度-時(shi)間變化(hua)曲線。可見兩種凍(dong)存管中(zhong)細(xi)胞(bao)皆可以遵循細(xi)胞(bao)凍(dong)存及復蘇的慢凍(dong)速溶基本原則(ze)，從(cong)而為(wei)較(jiao)好的保(bao)存細(xi)胞(bao)活力提供可能(neng)，包(bao)括在細(xi)胞(bao)冷凍(dong)存儲和(he)解凍(dong)過程中(zhong)，細(xi)胞(bao)存活率參數的水平需多關注。

進一步的，采用人臍帶血造血祖細(xi)胞(HPC-Cord)、牙髓間充(chong)質干細(xi)胞(DPSCs)和子宮(gong)、內膜間充(chong)質干細(xi)胞(ERCs)來(lai)確定無菌凍存(cun)管（左邊是CellSeal，右邊是Corning）的性能。

圖2: 顯微鏡下觀察在CellSeal和Corning 凍存管中冷凍保存的DPSCs和ERCs的貼壁和擴增(zeng)狀態

圖3：用(yong)10% DMSO和Cryostor(CS-10)作為CPA冷凍保存時，在CellSeal和Corning小瓶中(zhong)DPSCs和ERCs解凍后(hou)的細胞(bao)活率

如上(shang)可(ke)知(zhi)美國Sexton品牌CellSeal無菌冷(leng)凍(dong)(dong)凍(dong)(dong)存管(guan)可(ke)作為儲存和(he)運輸的(de)(de)(de)生物(wu)材料的(de)(de)(de)臨床應(ying)用(yong)的(de)(de)(de)一種封閉系統(tong)低溫設備。與(yu)市(shi)場上(shang)已(yi)有(you)的(de)(de)(de)對照產品-康(kang)寧(ning)凍(dong)(dong)存管(guan)相比，CellSeal中細胞的(de)(de)(de)冷(leng)卻(que)和(he)解凍(dong)(dong)速度(du)以及解凍(dong)(dong)后(hou)的(de)(de)(de)存活率無過大差異。

CellSeal無菌冷凍凍存管在作為一種MSCs細胞制劑臨床用藥包容器的應用

對(dui)于“ 現貨型” 的(de)(de)(de)異體臨床移植或(huo)輸注治療應用(yong)，通常(chang)需要大量(liang)冷凍儲存的(de)(de)(de)MSC。在治療過程中在常(chang)用(yong)的(de)(de)(de)細胞濃(nong)度下冷凍會產生大量(liang)含有不良數量(liang)DMSO的(de)(de)(de)制劑產品。因此(ci)高濃(nong)度細胞冷凍可減少輸注DMSO的(de)(de)(de)總量(liang)，進而可降低輸注相關毒性的(de)(de)(de)發生率(lv)。

圖(tu)-基于Sexton CellSeal無菌(jun)冷凍凍存管的冷凍ASC的臨床方案流程

本研(yan)究的(de)(de)目的(de)(de)是確定在降(jiang)低DMSO濃(nong)度(du)下(xia)低溫保存(cun)(cun)高(gao)濃(nong)度(du)間充(chong)質干(gan)(gan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)是否會對脂肪來源成體(ti)干(gan)(gan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(ASC)的(de)(de)存(cun)(cun)活率(lv)、干(gan)(gan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)特性和體(ti)內移植潛(qian)力(li)產生不利影響。在研(yan)究中(zhong)(zhong)作為(wei)藥包(bao)容器用(yong)途的(de)(de)CellSeal封(feng)閉系(xi)統凍(dong)存(cun)(cun)管(guan)中(zhong)(zhong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)制劑凍(dong)存(cun)(cun)液中(zhong)(zhong)的(de)(de)DMSO最(zui)終(zhong)濃(nong)度(du)為(wei)5%v/v，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)濃(nong)度(du)為(wei)1 000萬/mL，用(yong)被(bei)動(dong)冷卻系(xi)統以(yi)1℃/min降(jiang)溫速度(du)下(xia)程(cheng)序性降(jiang)溫至(zhi)-80°C左右(you)，然后將(jiang)此(ci)含(han)有5%DMSO高(gao)濃(nong)度(du)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)CellSeal凍(dong)存(cun)(cun)管(guan)轉入液氮LN2環境中(zhong)(zhong)長期(qi)保存(cun)(cun)（本次(ci)實驗保存(cun)(cun)時間為(wei)1周）。解(jie)凍(dong)后的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)被(bei)稀釋(shi)并分析其活力(li)和功(gong)能。如圖4所(suo)示解(jie)凍(dong)后，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)可一步稀釋(shi)到(dao)等滲回輸(shu)用(yong)培養(yang)基中(zhong)(zhong)（免洗），最(zui)終(zhong)DMSO濃(nong)度(du)為(wei)0.45%，不會因為(wei)離心或清洗而損失細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。

圖A&B：CellSeal凍(dong)存管中(zhong)(zhong)不同種類細胞和CPA（DMSO）濃度條件(jian)下在-85℃冰(bing)箱中(zhong)(zhong)被動冷凍(dong)和在37℃的水浴中(zhong)(zhong)加熱升溫時所經歷(li)的溫度-時間曲(qu)線

液氮(dan)LN2環(huan)境下(xia)(xia)(xia)保(bao)存(cun)(cun)一周后，在(zai)不同細(xi)胞和CPA濃度下(xia)(xia)(xia)冷(leng)凍(dong)(dong)保(bao)存(cun)(cun)的CellSeal凍(dong)(dong)存(cun)(cun)管中ASC解凍(dong)(dong)后的即時活率(lv)和細(xi)胞回收數量統計如下(xia)(xia)(xia)表1和表2。

不同細胞數量和CPA濃度(du)下(xia)冷凍保存的ASC解(jie)凍后(hou)的克隆性(xing)(CFU-F)能(neng)力(li)如下(xia)圖(tu)6和表(biao)3：

不同細胞數(shu)和CPA濃度(du)下凍存(cun)ASC解凍后的分化(hua)潛(qian)力(li)如下圖7：

繼續的對于以(yi)1000萬/mL細胞(bao)濃(nong)度組冷(leng)凍(dong)保存的ASCs解凍(dong)后進(jin)行流式細胞(bao)術(shu)FACS分(fen)析相關表(biao)面maker表(biao)達，結果如下：

可以(yi)發現復(fu)蘇(su)后的ASCs大部分(fen)都表(biao)達CD105、CD73和CD90，不表(biao)達CD45、CD34等表(biao)面標記，MSCs純度(du)比較高，具(ju)備更好的移植潛力。

因此(ci)我們發現在此(ci)CellSeal無菌(jun)冷凍(dong)凍(dong)存(cun)管可(ke)作為(wei)一(yi)種MSCs細(xi)胞(bao)(bao)制劑(ji)臨床(chuang)用藥(yao)包容器，本研(yan)究(jiu)(jiu)中凍(dong)存(cun)的(de)(de)ASCS在5% DMSO中以1000萬細(xi)胞(bao)(bao)/毫升(sheng)的(de)(de)濃度冷凍(dong)和(he)解凍(dong)回收后顯示出較高(gao)的(de)(de)功能活性，Cellseal在研(yan)究(jiu)(jiu)中涉及的(de)(de)凍(dong)存(cun)復蘇流程可(ke)以在不需要洗滌細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)情況下，以較小(xiao)的(de)(de)DMSO殘余(yu)劑(ji)量(liang)給藥(yao)治(zhi)療細(xi)胞(bao)(bao)，并(bing)且通過進一(yi)步(bu)的(de)(de)FACS檢測研(yan)究(jiu)(jiu)檢測解凍(dong)后ASC較好的(de)(de)體(ti)內移植潛(qian)力。