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細(xi)(xi)胞(bao)(bao)治療(liao)因(yin)其具體獨(du)特的(de)(de)靶向作用(yong)和(he)長(chang)期療(liao)效，成為新藥研發的(de)(de)熱點。隨著細(xi)(xi)胞(bao)(bao)療(liao)法逐漸步入臨(lin)床試驗，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)培(pei)(pei)養尤(you)為重要，從(cong)而(er)對細(xi)(xi)胞(bao)(bao)培(pei)(pei)養基補(bu)(bu)(bu)充劑(ji)的(de)(de)需求也越(yue)來(lai)(lai)越(yue)大。胎(tai)(tai)牛(niu)(niu)血(xue)清(qing)（FBS）一直以來(lai)(lai)被作為是細(xi)(xi)胞(bao)(bao)培(pei)(pei)養的(de)(de)常(chang)用(yong)補(bu)(bu)(bu)充劑(ji)，遺(yi)憾的(de)(de)是涉(she)及倫(lun)理和(he)安全(quan)問(wen)題(ti)。如今，從(cong)加工過(guo)的(de)(de)血(xue)液(ye)中提取(qu)的(de)(de)人(ren)源培(pei)(pei)養基補(bu)(bu)(bu)充劑(ji)已經(jing)得到越(yue)來(lai)(lai)越(yue)多(duo)的(de)(de)使用(yong)。人(ren)血(xue)小(xiao)板(ban)裂(lie)解液(ye)（hPL）是可用(yong)于臨(lin)床和(he)商業化(hua)制備細(xi)(xi)胞(bao)(bao)治療(liao)產品的(de)(de)補(bu)(bu)(bu)充劑(ji)之(zhi)一。hPL來(lai)(lai)源于混合人(ren)的(de)(de)血(xue)小(xiao)板(ban)，經(jing)連續反(fan)復多(duo)次的(de)(de)凍融裂(lie)解獲(huo)得，其含有的(de)(de)生長(chang)因(yin)子和(he)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)因(yin)子與胎(tai)(tai)牛(niu)(niu)血(xue)清(qing)（FBS）和(he)人(ren)AB血(xue)清(qing)相同(tong)且(qie)含量(liang)相當。

另一方面，細胞治療的人原代細胞體外培養及擴增并非易事，國家食品藥品監督管理總局組織制定的《細胞治療產品研究與評價技術指導原則（試行）》中有明確指出：“細胞培養過程中，應盡量避免使用動物來源的物質，比如應盡量避免血清的使用，若必須使用血清，需要提供相關的研究資料說明使用的必要性和合理性；嚴禁使用疫病流行區來源的動物血清；不得使用未經過安全性驗證的血清”。

因此，探索更加安全、成分更加明確的血清替代物對于細(xi)胞治(zhi)療(liao)產品的穩定(ding)持續生(sheng)產至關(guan)重要。

01 E-beam原理(li)和傳統(tong)γ-輻(fu)照技術

一(yi)(yi)般而言，血小板（hPL的(de)制(zhi)作原材料）相關的(de)篩查和(he)測試標準是(shi)(shi)與輸(shu)血前血液篩查相同。我(wo)們知道，傳(chuan)(chuan)(chuan)染性(xing)病原體（特(te)別(bie)是(shi)(shi)人(ren)類(lei)傳(chuan)(chuan)(chuan)染病病毒(du)）的(de)傳(chuan)(chuan)(chuan)播是(shi)(shi)人(ren)類(lei)血小板衍(yan)生(sheng)產品（如hPL）的(de)一(yi)(yi)個考慮因(yin)素，且(qie)多個供體的(de)混合(he)血小板裂解液雖可提高(gao)hPL批(pi)間一(yi)(yi)致性(xing)和(he)性(xing)能，但同時(shi)增(zeng)加了病毒(du)污染的(de)風(feng)險(xian)。

通(tong)常，醫療和食(shi)品(pin)通(tong)過電(dian)子(zi)(zi)束（E-beam）或γ射線輻照(zhao)滅殺病毒。有(you)研(yan)究(jiu)表明，通(tong)過γ照(zhao)射hPL能(neng)有(you)效地滅活病毒，但會造成hPL的(de)(de)(de)部分(fen)生(sheng)長因子(zi)(zi)喪(sang)失、不良(liang)的(de)(de)(de)產物特性（如渾濁(zhuo)現象(xiang)），以及(ji)細胞擴增(zeng)效能(neng)降(jiang)低的(de)(de)(de)影響。因此，通(tong)常還需通(tong)過添加蛋白質穩定劑(ji)等額外的(de)(de)(de)步驟來(lai)減輕不良(liang)影響，但又可能(neng)會引(yin)入新的(de)(de)(de)風險問題。

圖(tu)1 Sexton品牌病原(yuan)體減少PR工藝(yi)設計流程

與傳統的γ輻射方式不同，美國Sexton公司生產了一種pathogen-reduced病原體減少的hPL (PR hPL)，采用電子束照射（E-beam）的過程來降低病毒傳播的風險。E-beam原理：通過電子束直接作用，電子束激發水分子產生羥基自由基、還原性水合電子等活性粒子的氧化-還原的間接作用，對包括病毒等微生物體內的DNA或RNA分子以及蛋白質包膜產生破壞，進而達到病毒減少工藝的作用效果。

美(mei)國Sexton PR系列(lie)產品，依照國際人用藥(yao)品注冊技術協調會ICH/295/95和世衛組(zu)織WHO相關附(fu)件被(bei)用作設計病毒(du)清除驗(yan)證的(de)(de)(de)指南，建立(li)待驗(yan)證工(gong)(gong)藝的(de)(de)(de)縮小(xiao)模(mo)型(xing)，將工(gong)(gong)廠生產的(de)(de)(de)nLiven PR，運送(song)到(dao)測試實(shi)驗(yan)室(shi)，在(zai)待驗(yan)證樣(yang)品中人為(wei)地(di)加入一(yi)定種類和數(shu)量的(de)(de)(de)病毒(du)（針對血(xue)漿來(lai)源常規的(de)(de)(de)代(dai)表性模(mo)型(xing)病毒(du)）。然后(hou)產品進行病毒(du)去除/滅(mie)活(huo)工(gong)(gong)藝步驟，處理(li)，并返(fan)回到(dao)測試實(shi)驗(yan)室(shi)進行病毒(du)減少驗(yan)證分析。

圖2 Sexton品(pin)牌(pai)病原體減少PR工藝(yi)設計流程

通過對經PR工(gong)藝處理(li)的Sexton PR系列hPL產品進行生(sheng)長因子水平和(he)病毒測試（流程(cheng)見圖(tu)2：左圖(tu)是(shi)E-beam處理(li)hPL后的生(sheng)長因子分析和(he)細(xi)胞(bao)(bao)擴增實(shi)驗，右圖(tu)是(shi)E-beam處理(li)hPL后的病毒分析），可證明PR工(gong)藝可以實(shi)現在不顯(xian)著影響hPL組(zu)成和(he)hPL功能(neng)的情況下(xia)，實(shi)現病原(yuan)體減少，發揮(hui)良好的細(xi)胞(bao)(bao)培養補充物性能(neng)。

02 實驗部分

1. 細胞因子水平驗證

針對以下的(de)常(chang)見(jian)hPL中的(de)細胞(bao)因(yin)子(zi)(zi)，使用ELISA法對普通hPL（藍色(se)）和電子(zi)(zi)束輻照的(de)nLiven PR（紅色(se)），分(fen)別進(jin)行3組(zu)重復分(fen)析求取平均值(zhi)，用以評價PR工藝對hPL產(chan)品(pin)細胞(bao)因(yin)子(zi)(zi)含量(liang)的(de)影響。

圖3 PR工(gong)藝的hPL中(zhong)FGF/EGF/PDGF-AB/ TGF-β/ PDGF-BB水平比較

實驗(yan)發現：除了(le)3A圖(tu)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)FGF水平，其他細胞(bao)因子（如3B圖(tu)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)EGF、3C圖(tu)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)PDGF-AB、3D圖(tu)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)TGF-β以及3E圖(tu)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)PDGF-BB）在通過電子束照(zhao)射（E-beam）的(de)(de)(de)PR工(gong)藝獲得的(de)(de)(de)hPL中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)含(han)量與普通hPL對比是相(xiang)對偏(pian)高的(de)(de)(de)。

2. 細胞擴增(zeng)生長(chang)驗證

實驗人員(yuan)以(yi)BM-MSCs培養(yang)實驗為(wei)例來驗證PR工藝hPL的產品性能。

圖4 PR工藝的hPL與(yu)其(qi)他補充劑的細胞擴增(zeng)數目與(yu)形態比(bi)較

將BM-MSCs以2X10*4個細(xi)胞(bao)/孔的(de)密度接種在12孔板中(zhong)，培(pei)養(yang)(yang)4~5天(tian)，收獲后計數。比較在含有hPL、PR hPL和γ-輻(fu)照(zhao)FBS的(de)培(pei)養(yang)(yang)基中(zhong)培(pei)養(yang)(yang)的(de)BM-MSCs的(de)細(xi)胞(bao)增殖率。

BM-MSCs相對細胞(bao)擴增數(shu)結果比(bi)較：Sexton品(pin)(pin)牌(pai)的(de)Stemulate產(chan)品(pin)(pin)和PR工藝的(de)nLiven PR產(chan)品(pin)(pin)相對于(yu)γ-輻照的(de)FBS組獲得更多的(de)細胞(bao)擴增數(shu)目(mu)。BM-MSCs細胞(bao)形態比(bi)較：Sexton品(pin)(pin)牌(pai)的(de)兩款hPL相對于(yu)γ-輻照的(de)FBS細胞(bao)生長更為致密和均一(yi)。

3. 病原體減少(shao)工藝的驗證

使用(yong)牛病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)性腹瀉病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)（BVDV）進(jin)行(xing)標準病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)空斑試驗，用(yong)以評估生產工(gong)藝去除/滅活病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)能力，進(jin)行(xing)相關病(bing)(bing)原(yuan)體(ti)減(jian)少/去除效(xiao)果的(de)(de)驗證。主(zhu)要在應用(yong)電(dian)子束(shu)處(chu)理病(bing)(bing)原(yuan)體(ti)步(bu)驟之前，將BVDV刺(ci)突病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)引入樣品，然后對經(jing)電(dian)子束(shu)處(chu)理過的(de)(de)樣本(ben)進(jin)行(xing)殘留病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)分(fen)析。如下圖表(biao)中所示(shi)PR工(gong)藝的(de)(de)hPL的(de)(de)顯示(shi)模型(xing)包膜(mo)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)BVDV減(jian)少了6個對數值。

圖表 病原體(ti)減少結果

4. 其他PR工藝的hPL生化(hua)指標

圖5  PR工藝的hPL關于滲透(tou)壓(ya)、pH以及總蛋白的批間一致性數據展示

結果顯示：美國Sexton品牌的nLiven PR血小板裂解液使用E-Beam進行病原體處理的產品關于滲透壓、pH以及總蛋白的32個批次的一致性數據展示，可見CV值小于10%，展現了nLiven PR產品良好的批次間一致性。

03 文末結論

通過(guo)實驗(yan)驗(yan)證，在(zai)Stemulate或nLiven PR中生(sheng)長(chang)的BM-MSCs始終顯示出強勁的細(xi)胞(bao)擴(kuo)增(zeng)，nLiven PR尤為明顯。在(zai)其(qi)他干細(xi)胞(bao)擴(kuo)增(zeng)實驗(yan)中，結果也如此。

圖6 Sexton品(pin)牌的nLiven PR、Stemulate以及T-Liven PR產品(pin)

Sexton Biotechnologies的(de)(de)nLiven PR是(shi)一種經過驗(yan)(yan)證的(de)(de)、強大(da)的(de)(de)病(bing)原體減少工藝處理(li)的(de)(de)產品，為(wei)細(xi)(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)(yang)提供一致的(de)(de)、高質量的(de)(de)培(pei)養(yang)(yang)基添加物。與nLiven PR不同的(de)(de)是(shi)，Sexton公司(si)的(de)(de)T-Liven PR是(shi)PR處理(li)的(de)(de)血小(xiao)板裂解液的(de)(de)封閉袋裝系統版(ban)本，包括T細(xi)(xi)胞(bao)生長驗(yan)(yan)證試驗(yan)(yan)的(de)(de)放行測試，確保免疫細(xi)(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)(yang)過程中的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)質量。

有趣的是，T-Liven PR在被(bei)應用于T細胞(bao)等免疫細胞(bao)相關治(zhi)療(liao)時，對于CAR轉導T細胞(bao)的表型也(ye)被(bei)發(fa)現具有顯著的優勢(shi)。(Torres-Chavez等人(ren)2019年，請聯系曼博生物獲取相關文(wen)獻(xian)資料)