發布時間：2025/03/20 點擊數：1486 前言(yan)
現(xian)如今細胞(bao)(bao)治療因(yin)(yin)為(wei)相較(jiao)于傳統藥物的(de)(de)(de)(de)獨特的(de)(de)(de)(de)靶(ba)向性作用機制和長期的(de)(de)(de)(de)療效體(ti)現(xian)成為(wei)新藥研發的(de)(de)(de)(de)熱(re)點，隨著越(yue)來(lai)越(yue)多(duo)的(de)(de)(de)(de)細胞(bao)(bao)療法(fa)進(jin)入臨床(chuang)應用，對高(gao)質量、兼容不同細胞(bao)(bao)類(lei)型、穩定供應的(de)(de)(de)(de)細胞(bao)(bao)培養(yang)基補充(chong)劑(ji)的(de)(de)(de)(de)需求越(yue)來(lai)越(yue)大。人血小板(ban)(ban)裂解(jie)液(hPL)是(shi)幾(ji)種可用于臨床(chuang)和商(shang)業(ye)化生產制造細胞(bao)(bao)治療產品(pin)的(de)(de)(de)(de)補充(chong)劑(ji)之一。hPL來(lai)源于混合(he)人的(de)(de)(de)(de)血小板(ban)(ban)裂解(jie)物，與含有在胎牛血清(qing)(FBS)和人AB血清(qing)中相同的(de)(de)(de)(de)生長因(yin)(yin)子(zi)和細胞(bao)(bao)因(yin)(yin)子(zi)相當的(de)(de)(de)(de)水平。
美國Sexton品牌的(de)hPL系(xi)列產品，左邊(bian)為PR工藝的(de)nLiven
E-beam原理以及和(he)傳(chuan)統輻照的(de)區(qu)別(bie)
一般而言hPL的(de)制(zhi)作原材料(liao)血小板(ban)相關(guan)的(de)篩(shai)查和(he)測試標(biao)準是(shi)與輸(shu)血前血液篩(shai)查相同(tong)(tong)，以此將hPL原材料(liao)安全風(feng)險控(kong)制(zhi)在較低(di)的(de)水平。但(dan)我們知(zhi)道傳(chuan)(chuan)染性(xing)病(bing)(bing)原體(特(te)別是(shi)人類病(bing)(bing)毒)的(de)傳(chuan)(chuan)播仍然(ran)是(shi)人類血小板(ban)衍生產品(pin)(如hPL)的(de)一個考慮(lv)因素，且多個捐贈(zeng)者的(de)混合血小板(ban)裂解液可以提高hPL批間一致(zhi)性(xing)和(he)性(xing)能，但(dan)同(tong)(tong)時增加了病(bing)(bing)毒污(wu)染的(de)風(feng)險。
對于(yu)這些(xie)的(de)病毒處(chu)理，電子束和伽瑪輻(fu)射(she)都(dou)具有相同的(de)電離輻(fu)射(she)對核酸的(de)損傷機制，常(chang)用于(yu)醫療和食(shi)品的(de)輻(fu)照(zhao)。有研究表明，伽瑪照(zhao)射(she)能(neng)有效地滅活病毒，但不(bu)可(ke)避免的(de)帶來些(xie)許生長因(yin)子的(de)喪失，不(bu)良的(de)產物特性(渾濁現象)，以及(ji)細胞擴增水平的(de)整體降低。因(yin)此通常(chang)還需要額外的(de)步(bu)驟(zou)，如添(tian)加(jia)蛋白質穩定劑(ji)，以對抗這些(xie)影(ying)響(xiang)，但這些(xie)步(bu)驟(zou)需要額外的(de)表征(zheng)，從而會引入(ru)了(le)新的(de)風(feng)險問題。
圖1 Sexton品(pin)牌病原體(ti)減少(shao)PR工(gong)藝(yi)設計流程
與傳(chuan)統的伽瑪輻射(she)方式(shi)不(bu)同(tong)，美(mei)國Sexton公司(si)生(sheng)(sheng)產(chan)了一(yi)種(zhong)pathogen-reduced病原(yuan)體減(jian)少(shao)的hPL (PR hPL)，采用電子(zi)(zi)束(shu)(shu)照射(she)(E-beam)的過程來降低病毒傳(chuan)播的風(feng)險。如圖(tu)1所示E-beam主要通過電離輻射(she)的原(yuan)理(li)，通過電子(zi)(zi)束(shu)(shu)直接作用，以及(ji)電子(zi)(zi)束(shu)(shu)激發水分(fen)子(zi)(zi)產(chan)生(sheng)(sheng)羥基自由基、還原(yuan)性水合電子(zi)(zi)等活性粒子(zi)(zi)的氧化-還原(yuan)的間接作用，對包(bao)括病毒等微生(sheng)(sheng)物體內的DNA或(huo)RNA分(fen)子(zi)(zi)以及(ji)蛋白(bai)質包(bao)膜產(chan)生(sheng)(sheng)破壞，進(jin)而達到病毒減(jian)少(shao)工(gong)藝的作用效果。
美(mei)國(guo)(guo)Sexton PR系列產品是(shi)依照國(guo)(guo)際(ji)人用藥品注冊技術協調會ICH/295/95和世衛組織WHO相(xiang)關附件被(bei)用作設計病(bing)(bing)毒清除(chu)驗證的(de)(de)(de)指南，建立待驗證工藝的(de)(de)(de)縮小模型，將工廠(chang)生產的(de)(de)(de)nLiven PR，運送到(dao)測試實驗室(shi)，在待驗證樣品中人為地加入一定種類和數量(liang)的(de)(de)(de)病(bing)(bing)毒（針對血漿來(lai)源常規的(de)(de)(de)代表性模型病(bing)(bing)毒）。然后(hou)產品進(jin)行(xing)病(bing)(bing)毒去除(chu)/滅活工藝步(bu)驟(zou)，處理(li)，并(bing)返回(hui)到(dao)測試實驗室(shi)進(jin)行(xing)病(bing)(bing)毒減(jian)少驗證分析(xi)。
圖2 Sexton品牌病原體(ti)減(jian)少(shao)PR工藝(yi)設計流程(cheng)
今天(tian)小編將(jiang)介紹這種病(bing)原體減少(shao)工(gong)(gong)藝(yi)制作的(de)PR hPL，主要分別進行(xing)生長因(yin)子(zi)水平和(he)病(bing)毒測試(流(liu)程見(jian)圖(tu)2：左圖(tu)是E-beam處理hPL后的(de)生長因(yin)子(zi)分析(xi)和(he)細(xi)胞擴增實(shi)驗，右圖(tu)是E-beam處理hPL后的(de)病(bing)毒分析(xi)），演示了PR工(gong)(gong)藝(yi)可以實(shi)現在不(bu)顯著影(ying)響hPL組成和(he)hPL功能的(de)情況(kuang)下實(shi)現病(bing)原體減少(shao)作為良(liang)好的(de)細(xi)胞培(pei)養補充物性能。
實驗部分
1、細(xi)胞(bao)因(yin)子水平(ping)驗證
圖3 PR工藝(yi)的hPL中FGF/EGF/PDGF-AB/ TGF-β/ PDGF-BB水平比較
使用ELISA 等(deng)方法對(dui)(dui)于伽(jia)瑪輻射的(de)普(pu)通(tong)hPL（（藍色(se)））和電子束(shu)(shu)的(de)nLiven（紅色(se)）針對(dui)(dui)以下的(de)常見hPL中(zhong)(zhong)的(de)細(xi)胞(bao)因(yin)(yin)子分別(bie)進行3組重復(fu)分析(xi)求取(qu)平均值，該實(shi)驗中(zhong)(zhong)發現(xian)除(chu)了3A圖中(zhong)(zhong)的(de)成纖(xian)維細(xi)胞(bao)生(sheng)長(chang)因(yin)(yin)子（FGF）水平，其(qi)他細(xi)胞(bao)因(yin)(yin)子如3B圖中(zhong)(zhong)的(de)內皮生(sheng)長(chang)因(yin)(yin)子(EGF)、3C圖中(zhong)(zhong)的(de)血(xue)小板(ban)衍生(sheng)生(sheng)長(chang)因(yin)(yin)子AB (PDGF-AB)、3D圖中(zhong)(zhong)的(de)組織(zhi)生(sheng)長(chang)因(yin)(yin)子β (TGF-β)以及3E中(zhong)(zhong)的(de)血(xue)小板(ban)衍生(sheng)生(sheng)長(chang)因(yin)(yin)子BB (PDGF-BB)在(zai)通(tong)過電子束(shu)(shu)照射(E-beam)的(de)PR工藝獲得的(de)hPL中(zhong)(zhong)含量是相對(dui)(dui)偏高的(de)。
接著實驗(yan)人員以(yi)骨髓來(lai)源的(de)間充質干(gan)細胞(BM-MSCs)培養(yang)實驗(yan)為例來(lai)驗(yan)證PR工藝(yi)hPL的(de)產品性能。
2、細胞擴增生長驗證
圖4 PR工(gong)藝的hPL與其他(ta)補充劑(ji)的細(xi)胞擴增(zeng)數目與形態比(bi)較(jiao)
將BM-MSCs以20000個細(xi)(xi)胞/孔的比例接種(zhong)在(zai)12孔板中。細(xi)(xi)胞培(pei)養(yang)4到5天，收獲后使用細(xi)(xi)胞活力分析儀進行總(zong)細(xi)(xi)胞計數。分別比較(jiao)在(zai)含有(you)hPL、PR hPL和(he)γ -輻照FBS的培(pei)養(yang)基(ji)中培(pei)養(yang)的骨(gu)髓間充(chong)(chong)質干細(xi)(xi)胞BM-MSC的細(xi)(xi)胞增殖率。在(zai)三組培(pei)養(yang)基(ji)補(bu)充(chong)(chong)劑(ji)(ji)培(pei)養(yang)條件下(xia)(xia)的BM-MSC相(xiang)對細(xi)(xi)胞擴增數比較(jiao)結果中（圖4左(zuo)(zuo)），我們可以看(kan)出該(gai)實驗中美(mei)國Sexton品牌(pai)的stemulate和(he)PR工藝的nLiven產品相(xiang)對于γ輻照的FBS組獲得很多的細(xi)(xi)胞擴增數目(mu)，在(zai)顯微鏡下(xia)(xia)觀察(cha)獲得的三組培(pei)養(yang)基(ji)補(bu)充(chong)(chong)劑(ji)(ji)培(pei)養(yang)條件下(xia)(xia)的BM-MSC細(xi)(xi)胞形(xing)態比較(jiao)（圖4左(zuo)(zuo)）Sexton品牌(pai)的兩款hPL相(xiang)對于輻照的FBS細(xi)(xi)胞生長更(geng)為致密和(he)均一(yi)。
3、病原體減(jian)少工(gong)藝的驗證(zheng)
使用牛(niu)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒性(xing)腹瀉(xie)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(BVDV)進行(xing)標準病(bing)(bing)(bing)(bing)毒空斑(ban)試驗評估(gu)生產工藝(yi)去除和/或滅活病(bing)(bing)(bing)(bing)毒的(de)(de)(de)能力(li)，在小(xiao)規模(mo)的(de)(de)(de)生產工藝(yi)中(zhong)進行(xing)相(xiang)關病(bing)(bing)(bing)(bing)原(yuan)體減(jian)少(shao)/去除效果的(de)(de)(de)驗證。主要(yao)在應(ying)用電(dian)子束(shu)處理病(bing)(bing)(bing)(bing)原(yuan)體步(bu)驟之前，將BVDV刺突病(bing)(bing)(bing)(bing)毒引入樣品，然后對(dui)經電(dian)子束(shu)處理的(de)(de)(de)樣本進行(xing)殘留病(bing)(bing)(bing)(bing)毒分(fen)析。如上圖表(biao)2中(zhong)所(suo)示PR 工藝(yi)的(de)(de)(de)hPL的(de)(de)(de)顯(xian)示模(mo)型包膜病(bing)(bing)(bing)(bing)毒BVDV減(jian)少(shao)了(le)6個對(dui)數值。
4、其他PR工藝的hPL生化指標
圖5 PR工(gong)藝的(de)hPL關于滲(shen)透(tou)壓（Osmolality）、pH以及總(zong)蛋白(bai)的(de)批間(jian)一致性數據展(zhan)示
圖5種顯示美國(guo)Sexton品牌的nLiven血小(xiao)板(ban)裂解液池使用E-Beam進行病原體(ti)處(chu)理的產品關于(yu)滲透壓（Osmolality）、pH以及總(zong)蛋白的32個批次的一致(zhi)性數據展示，可(ke)見CV值小(xiao)于(yu)10%。
結論
通過以上對比我(wo)們可(ke)(ke)以發現在Stemulate或nLiven中(zhong)生長的(de)(de)骨髓間(jian)充(chong)質干(gan)細(xi)胞(bao)BM-MSC始終顯(xian)(xian)示出強勁的(de)(de)細(xi)胞(bao)擴(kuo)張，以nLiven培(pei)養性能相(xiang)對更(geng)明顯(xian)(xian)，而在輻射胎牛(niu)血清中(zhong)生長緩慢得多。類似的(de)(de)結果我(wo)們在其(qi)他(ta)來源的(de)(de)干(gan)細(xi)胞(bao)擴(kuo)增(zeng)實(shi)驗(yan)中(zhong)也(ye)得到了(le)證實(shi)，對項目擴(kuo)增(zeng)有特殊更(geng)高要求的(de)(de)客戶(hu)可(ke)(ke)以考(kao)慮從傳統的(de)(de)hPL過渡到PR工藝的(de)(de)hPL（nLiven）版本。Sexton Biotechnologies的(de)(de)nLiven PR是一種(zhong)經過驗(yan)證的(de)(de)、強大的(de)(de)病原體減少工藝，為細(xi)胞(bao)培(pei)養提供(gong)一致的(de)(de)、高質量的(de)(de)培(pei)養基補(bu)充(chong)。
與nLiven不同的是Sexton公司另外一(yi)款T-Liven PR是PR處理(li)的血小板裂解液的封(feng)閉袋(dai)裝(zhuang)系統版本，該產品涉及一(yi)系列包括t細(xi)(xi)胞生長驗(yan)證試驗(yan)的放行測試，確保免(mian)疫細(xi)(xi)胞培(pei)養過(guo)程(cheng)中(zhong)的細(xi)(xi)胞質(zhi)量。
并且有趣的是，盡管T-Liven PR中在被應用于T細胞等免疫細胞相關治療時，對于CAR轉導細胞的表型也被發現具有顯著的優勢。(Torres-Chavez等人2019年，請聯系曼博生物獲取相關文獻資料)
圖6 Sexton品牌的(de)T-Liven PR產品
