發布時間：2023/10/09 點擊數：386 縮小(xiao)差距--人體微生理(li)系統如何提(ti)高 NASH 藥物發現的可轉化性
本(ben)文亮(liang)點
1、CN-Bio的(de)NASH MPS模型的(de)全轉錄譜，相(xiang)比于小(xiao)鼠模型，與人類(lei)樣本匹配(pei)度更(geng)高。
2、NASH MPS模(mo)型(xing)與其他模(mo)型(xing)對NASH治(zhi)療藥(yao)物作用的效果(guo)比較表。
3、NASH MPS模(mo)型(xing)在可溶性炎(yan)癥和(he)纖(xian)維化生物(wu)標志物(wu)定量、免疫熒光(guang)染色和(he)共聚(ju)焦成像等方面準確復制了(le)近期臨(lin)床試驗中兩種NASH治療藥物(wu)（Aramchol和(he)Cenicriviroc）的效果。
前言
非(fei)酒(jiu)精(jing)性(xing)(xing)脂(zhi)(zhi)肪(fang)性(xing)(xing)肝(gan)炎（NASH）是非(fei)酒(jiu)精(jing)性(xing)(xing)脂(zhi)(zhi)肪(fang)肝(gan)病（NAFLD）的最嚴重形式，NAFLD 是在沒有(you)過量(liang)飲(yin)酒(jiu)的情況(kuang)下，由于飲(yin)食和(he)(he)生活方式而導致(zhi)的肝(gan)臟中脂(zhi)(zhi)肪(fang)堆積的一系列病理(li)變(bian)化的代謝性(xing)(xing)疾病,大約有(you)20％被(bei)診斷為NAFLD的人(ren)從良性(xing)(xing)的肝(gan)脂(zhi)(zhi)肪(fang)變(bian)性(xing)(xing)到（NASH）， 伴(ban)隨著脂(zhi)(zhi)肪(fang)變(bian)性(xing)(xing)、炎癥、肝(gan)臟中免疫細胞的出現和(he)(he)胰島素抵抗，肝(gan)損傷(shang)和(he)(he)肝(gan)細胞周圍纖(xian)維(wei)化，最終(zhong)可(ke)導致(zhi)肝(gan)硬化和(he)(he)肝(gan)癌(圖1)。
圖1 - 人類(lei)肝臟(zang)NAFLD/NASH發展(zhan)示意(yi)圖
迄今(jin)為(wei)(wei)止，當前的(de)臨床前試驗主要基于2D和體(ti)內動物(wu)模型(xing)，一直未能(neng)持續準確預測人(ren)(ren)體(ti)藥物(wu)的(de)有效性，因(yin)為(wei)(wei)它們缺乏(fa)可轉化(hua)性，并且未能(neng)充分再現這種人(ren)(ren)類(lei)疾病的(de)復雜性和多方面特性。
微(wei)生(sheng)理(li)學系統（MPS）通(tong)過復制人體器(qi)官的(de)特(te)性，提供了潛在的(de)解決方(fang)案，CN-Bio的(de)PhysioMimix NASH MPS模型由(you)原代人肝細胞(bao)（PHH）和非實質細胞(bao)共同培(pei)養，形成了3D微(wei)組織結(jie)構，位于灌(guan)注的(de)肝MPS板中。
將CN-Bio的NASH MPS模(mo)型的轉(zhuan)錄(lu)組(zu)圖譜(pu)與(yu)(yu)人(ren)類(lei)基因(yin)圖譜(pu)數(shu)據庫Human Gene Atlas database (www.ebi.ac.uk/gxa/home)進(jin)行比(bi)較(jiao)，并以圖形方式顯示識(shi)別的目標，相(xiang)比(bi)于(yu)小鼠模(mo)型，MPS的NASH模(mo)型的轉(zhuan)錄(lu)組(zu)學特征與(yu)(yu)來自人(ren)類(lei)樣本的轉(zhuan)錄(lu)組(zu)學更(geng)具有(you)相(xiang)關性（圖2）。
圖2 - NASH MPS 模型的(de)轉錄組(zu)學(xue)(xue)特征與(yu)來(lai)自(zi)人類樣(yang)本(ben)而非小(xiao)鼠模型樣(yang)本(ben)的(de)轉錄組(zu)學(xue)(xue)更具有相關性(xing)
我們先前已經通過驗證兩種抗NASH化合物對NASH MPS模型的效應，這些效應與臨床研究結果一致，減少了炎癥和纖維化1。在這里，我們進一步擴展了NASH MPS模型的驗證，通過評估四種目前正在進行晚期NASH/NAFLD臨床試驗的抗NASH化合物的效應。
材(cai)料與方法
原代人(ren)肝細(xi)胞(bao)被植入3D支(zhi)架中(zhong)，該支(zhi)架位于(yu)(yu)PhysioMimix Multi-chip Liver-12板內(nei)(nei)，并(bing)(bing)持(chi)續(xu)通過培養(yang)基灌注(zhu)，以提供必要(yao)的(de)營養(yang)、氧(yang)氣和(he)機械(xie)刺激(ji)。這(zhe)種微(wei)(wei)環境有助于(yu)(yu)形成(cheng)與生(sheng)理(li)相(xiang)關(guan)的(de)人(ren)類3D肝微(wei)(wei)組(zu)織，這(zhe)些微(wei)(wei)組(zu)織表現(xian)出高度的(de)代謝活(huo)性，并(bing)(bing)且(qie)能(neng)夠(gou)在4周內(nei)(nei)保(bao)持(chi)生(sheng)存。
肝MPS模型形成3D人肝微組織(zhi)（圖3）。
A）PhysioMimix Liver-12板的示(shi)意圖(tu)，包括一(yi)個開放的細胞培(pei)養孔的橫截面(mian)、3D支(zhi)架和流體流動。
B）從單個細胞到3D肝(gan)微組織，在7天培養(yang)中的形成。
圖(tu)3 - NASH MPS模型(xing)融合了三種經(jing)過(guo)驗(yan)證的3D培(pei)養(yang)(yang)(yang)細胞：原代(dai)人肝細胞（PHH）、人類庫普(pu)弗細胞以及星狀細胞。這些微(wei)組織在含游離脂肪(fang)酸和糖的HEP-Fat培(pei)養(yang)(yang)(yang)基中(zhong)培(pei)養(yang)(yang)(yang)，以誘導和維持NASH樣(yang)的表型(xing)，持續培(pei)養(yang)(yang)(yang)14天(tian)（圖(tu)4）。
圖4 - 使(shi)用肝(gan)MPS模(mo)型(xing)(xing)產生類(lei)似(si)NASH的表型(xing)(xing)。在(zai)HEP-Fat培養(yang)基中培養(yang)初級人(ren)肝(gan)細胞(bao)會生成類(lei)似(si)NASH的表型(xing)(xing)。
使(shi)用(yong)了(le)4種正(zheng)在(zai)(zai)進行(xing)(xing)臨(lin)床(chuang)測(ce)試(shi)的(de)抗(kang)NASH化合(he)物，在(zai)(zai)三個(ge)不同的(de)測(ce)試(shi)濃度(du)(du)下(xia)對我們(men)的(de)NASH模型進行(xing)(xing)了(le)評估：Selonsertib（0.5、2和(he)10 μM）、Aramchol（3.4、20.5和(he)205 μM）、Cenicriviroc（0.7、4.3和(he)43 μM）以及SB-431542（0.1、0.5和(he)2 μM），其中(zhong)最高濃度(du)(du)與臨(lin)床(chuang)試(shi)驗(yan)所用(yong)的(de)劑量(liang)相匹配。這些化合(he)物在(zai)(zai)NASH MPS模型中(zhong)的(de)抗(kang)NASH效應(ying)進行(xing)(xing)了(le)測(ce)量(liang)，包(bao)括炎癥、纖維(wei)化和(he)脂肪變性(xing)。這些化合(he)物在(zai)(zai)10天內，以三個(ge)臨(lin)床(chuang)相關濃度(du)(du)，每(mei)兩到三天一次進行(xing)(xing)投(tou)藥。可(ke)溶(rong)性(xing)炎癥和(he)纖維(wei)化生(sheng)物標(biao)志物使(shi)用(yong)Luminex測(ce)定，終點(dian)細胞外基(ji)質沉積情況則進行(xing)(xing)了(le)檢測(ce)。脂肪變性(xing)方面，并使(shi)用(yong)了(le)免疫熒光染色和(he)共(gong)聚(ju)焦成像進行(xing)(xing)了(le)定量(liang)測(ce)量(liang)。
結果
01、抗NASH化(hua)(hua)合物(wu)(wu)對(dui)減輕NASH MPS中炎(yan)癥和(he)纖(xian)維(wei)(wei)化(hua)(hua)表型的(de)(de)劑量反應(ying)效應(ying)（圖(tu)5），觀察時間為第14天(tian)。從空(kong)載(zai)對(dui)照（VC）、Elafibranor（ELF，陽性(xing)對(dui)照）和(he)4種抗NASH化(hua)(hua)合物(wu)(wu)的(de)(de)3個(ge)(ge)測試濃度(du)處理的(de)(de)培(pei)養基樣本中測定了IL-6（炎(yan)癥）和(he)纖(xian)維(wei)(wei)連(lian)接蛋白（纖(xian)維(wei)(wei)化(hua)(hua)）。所示數據為每個(ge)(ge)條(tiao)件的(de)(de)N = 3。通(tong)過應(ying)用Kruskal-Wallis檢驗（單因素方差(cha)分(fen)析）確定了與(yu)空(kong)載(zai)對(dui)照相(xiang)對(dui)的(de)(de)所有條(tiao)件的(de)(de)統(tong)計顯著(zhu)性(xing)。
圖5
02、總結抗NASH化(hua)合(he)物(wu)在抑(yi)制炎(yan)癥(zheng)、纖維(wei)化(hua)和(he)(he)脂肪變性生物(wu)標志物(wu)方面(mian)的zui gao濃度的正(zheng)面(mian)效(xiao)(xiao)(xiao)應（圖(tu)6）。從應用Kruskal-Wallis檢驗(yan)確定(ding)的P值(zhi)的熱圖(tu)，包括第14天與空(kong)載對(dui)照相對(dui)的所有(you)(you)4種抗NASH化(hua)合(he)物(wu)，包括纖維(wei)化(hua)（α-SMA和(he)(he)膠原(yuan)蛋(dan)白1型(xing)）的共聚焦顯微鏡(jing)圖(tu)像分析(xi)定(ding)量和(he)(he)肝小組織中脂肪積累，顯示(shi)了它們(men)在解決(jue)NASH方面(mian)的總體效(xiao)(xiao)(xiao)果（NS-與空(kong)載對(dui)照相比(bi)沒有(you)(you)顯著差異(yi)；P <0.0001顯示(shi)了針對(dui)NASH的最(zui)強的抑(yi)制效(xiao)(xiao)(xiao)應）。所示(shi)數(shu)據為每個條件的N = 3。
圖6
03、免疫(yi)熒光染(ran)色(se)證實(shi)的(de)NASH表型減(jian)少與共(gong)聚(ju)(ju)焦圖像分(fen)析一致(zhi)（圖7）。A- 共(gong)聚(ju)(ju)焦顯微鏡(jing)成像顯示了在(zai)第14天從使(shi)用VC，Elafibranor和(he)4種抗NASH化(hua)(hua)合物的(de)最(zui)高濃度處(chu)理的(de)樣(yang)本(ben)中(zhong)收集的(de)NASH小(xiao)組織。樣(yang)本(ben)在(zai) 4％的(de)甲醛中(zhong)固定(ding)，并用α-SMA（品紅色(se)），膠(jiao)原I型（綠色(se)），脂質（紅色(se)）和(he)Hoechst（藍色(se)）染(ran)色(se)。肝小(xiao)組織中(zhong)纖(xian)維化(hua)(hua)（α-SMA（B）和(he)膠(jiao)原I型（C））和(he)脂質積累（D）的(de)共(gong)聚(ju)(ju)焦顯微鏡(jing)圖像分(fen)析定(ding)量。
圖7
04、抗NASH化合物作用方式描述(shu)，及其(qi)在其(qi)他模型和我們的NASH MPS模型上對NASH關鍵特征的影(ying)響比較（表格1）。
表(biao)格(ge)1
結論
我們(men)的(de)NASH MPS模型準(zhun)確地再現了近期臨床試驗中兩種主要抗NASH化(hua)合物(wu)（Aramchol和(he)Cenicriviroc）的(de)效果。這說明NASH MPS模型為(wei)NASH治療的(de)藥物(wu)效力提(ti)供了可(ke)轉化(hua)的(de)見解(jie)，同時(shi)也為(wei)臨床前NASH篩選提(ti)供了有前途(tu)的(de)敏(min)感替代方(fang)案，有助于加速(su)決(jue)策(ce)制定和(he)市場(chang)準(zhun)入(ru)。
推薦閱讀
參考文獻
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