將人(ren)類淋(lin)巴(ba)母細(xi)胞(bao)(TK6細(xi)胞(bao))集成到肝臟(zang)芯片(pian)中用于(yu)基因(yin)毒性測試(shi):順應潮流,減少動物(wu)實驗
本(ben)文概況
來自國際知(zhi)名的藥物發現(xian)和(he)臨床前服務實驗室--Charles River的研究團隊,將英國CN-Bio的肝(gan)臟芯片(Liver-on-Chip,LOC)技術,應(ying)用(yong)于(yu)遺傳毒性測(ce)試,初(chu)次產生(sheng)了更有(you)預測(ce)性的人體(ti)結(jie)果,潛在地有(you)助于(yu)彌補體(ti)外(wai)和(he)體(ti)內研究之(zhi)間的差距。
前(qian)言
目前的體(ti)外臨床前遺(yi)傳毒性測試(shi)體(ti)系包括(kuo)在單(dan)個(ge)細胞和細菌中(zhong)使用代(dai)(dai)謝(xie)活化系統"Induced rat S9 mix",來確定(ding)藥物(wu)代(dai)(dai)謝(xie)和遺(yi)傳毒性。"Induced rat S9 mix"試(shi)劑主要(yao)由Sprague Dawley(SD)大鼠(shu)肝(gan)臟的S9部(bu)分構成,富含(han)藥物(wu)代(dai)(dai)謝(xie)酶(mei),包括(kuo)P-450等。
在臨床前研究中,大量藥物(wu)開發失敗是由(you)于(yu)意外的毒(du)性效(xiao)應(ying),通常與肝臟生物(wu)轉化(hua)有關(種間差異性)。來自Charles River的研究團隊將CN-Bio的肝臟芯片(Liver-on-Chip,LOC)技術,應(ying)用(yong)于(yu)遺傳毒(du)性測試產生了更有預測性的人體結果,潛在地有助于(yu)彌(mi)補體外和體內研究之間的差距(圖1)。
圖1 - 肝臟芯片(pian) (Liver-on-Chip,LOC) 可能有助于(yu)彌(mi)補體(ti)內和體(ti)外研究之間的差(cha)距(ju)。
研究目(mu)標(biao)
本研(yan)究的(de)目(mu)標(biao)是(shi)重建具有人類代(dai)謝功能的(de)肝(gan)臟芯片(Liver-on-Chip,LOC)的(de) 3D 器官(guan)微環境,采用(yong)原代(dai)人肝(gan)細(xi)胞(bao)(PHH)或HepaRG細(xi)胞(bao)構建,與人類淋巴母細(xi)胞(bao)(TK6細(xi)胞(bao))進(jin)行共培養,從而用(yong)于遺傳毒性(xing)評估。
材料與方(fang)法
如下圖(tu)2:
(A)采用與遺傳毒性測試中體內試驗相(xiang)同(tong)的時間表(biao)進行(xing)處理,(B)用于培(pei)養共培(pei)養系(xi)統的板,(C)微生理系(xi)統(Microphysiological System,MPS)
圖(tu)2
(D)肝(gan)臟芯片(pian)(Liver-on-chip,LOC)與TK6細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)共培養(yang)的(de)(de)示意圖,并(bing)說明如(ru)何(he)將每(mei)種(zhong)測(ce)定方法適應于該系(xi)統(tong)(tong)。該LOC由原(yuan)代人肝(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(PHH-LOC)或(huo)HepaRG細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(HepaRG-LOC)以及(ji)TK6細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)組成。該系(xi)統(tong)(tong)允許兩個隔(ge)室之間的(de)(de)通(tong)信,并(bing)進(jin)(jin)(jin)行(xing)多種(zhong)終點分(fen)析,例(li)如(ru)肝(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)中的(de)(de)彗(hui)星試驗(% tail DNA intensity)和(he)TK6細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)中的(de)(de)微核試驗(使(shi)用(yong)(yong)MicroFlow試劑(ji)盒(he)(Litron)進(jin)(jin)(jin)行(xing)流式(shi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)術)。兩個LOC(包(bao)括(kuo)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)外基質、內皮細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)、PHH或(huo)HepaRG和(he)Matrigel)均在(zai)CN-Bio的(de)(de)器官(guan)芯片(pian)系(xi)統(tong)(tong)技術下維持,TK6細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)在(zai)Transwell上進(jin)(jin)(jin)行(xing)培養(yang)。兩個隔(ge)室分(fen)別在(zai)0、24和(he)45小(xiao)時時,使(shi)用(yong)(yong)陰性對照(zhao)、直接誘變(bian)(bian)劑(ji)甲烷(wan)磺酸酯(zhi)(5μg/mL的(de)(de)MMS)或(huo)間接誘變(bian)(bian)劑(ji)苯并(bing)[a]芘(bi)(10μg/mL的(de)(de)BaP)和(he)環磷酰胺(50μg/mL的(de)(de)CP)進(jin)(jin)(jin)行(xing)處理,陽性對照(zhao)使(shi)用(yong)(yong)變(bian)(bian)異(yi)誘導劑(ji)乙基甲磺酸酯(zhi)(EMS)。進(jin)(jin)(jin)行(xing)了(le)三次(ci)獨(du)立實(shi)驗,并(bing)收集了(le)肝(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)和(he)TK6細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)。
結果與討論(lun)
1、在(zai)共培養系統中的存活情況(kuang)
圖3:從LOC獲得(de)的(de)(de)(de)單細胞懸液(ye)的(de)(de)(de)存活情況進(jin)行了(le)(le)評估(臺盼(pan)藍(lan)染色法),并(bing)對TK6細胞進(jin)行了(le)(le)流式細胞分析。從與(yu)TK6細胞共(gong)培養的(de)(de)(de)HepaRG構(gou)建(jian)(jian)的(de)(de)(de)LOC(A)和與(yu)TK6細胞共(gong)培養的(de)(de)(de)PHH構(gou)建(jian)(jian)的(de)(de)(de)LOC(B)獲得(de)的(de)(de)(de)%存活率結(jie)果。NA=不適(shi)用。在微流控流動(dong)條件(jian)下培養了(le)(le)9天后的(de)(de)(de)(C)HepaRG-LOC和(D)PHH-LOC的(de)(de)(de)顯微鏡圖像(xiang)。
2、HepaRG細胞構建的肝(gan)(gan)臟芯片成(cheng)功(gong)地證(zheng)明了,使用CP獲得的數據與(yu)使用相同試驗描述的體內研究直(zhi)接相關:在肝(gan)(gan)臟中(zhong)影響不大(da)(%Tail DNA),但在淋(lin)巴(TK6)細胞中(zhong)表現為正面響應(ying)(% MN 增(zeng)加)。這些發現在HepaRG的2D模(mo)型或(huo)3D球體模(mo)型中(zhong)并(bing)未出現。
圖(tu)4:來自(zi)至少三(san)次獨立(li)實驗(yan)的(de)結果。
(A)使(shi)用HepaRG的HepaRG-LOC中HepaRG的彗星試驗(yan)結果。DNA損(sun)傷(shang)水平(% Tail DNA)。統計分析采用一(yi)元方差分析(one-way ANOVA)后進行Dunnet's多重比較檢驗(yan):*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001,ns=不(bu)顯著。
(B)使用(yong)HepaRG的HepaRG-LOC的TK6細(xi)胞微核(he)試驗結果。微核(he)頻(pin)率(% MN frequency)。統計分析采用(yong)t檢驗進行(xing),其中*p<0.05,**p≤0.005,****p<0.001。
3、使(shi)用原代(dai)人(ren)類肝細(xi)胞(bao)(PHH)構建(jian)的肝臟芯片(pian),TK6的結果表明,PHH-LOC更有效地代(dai)謝了測試的間(jian)接誘(you)變劑(CP和BaP),盡管在初(chu)級人(ren)類肝細(xi)胞(bao)中(zhong)某些(xie)活性較(jiao)低或較(jiao)高(gao),這很(hen)可能(neng)反映了供體之間(jian)的差異(yi)。
圖5:
(A)這些結(jie)(jie)果來自至少三次(ci)獨立的(de)實驗。在使用PHH的(de)PHH with LOC中進(jin)行的(de)彗星試驗結(jie)(jie)果顯示,通過一(yi)元(yuan)方差(cha)分析(ANOVA)和隨后的(de)Dunnet多重比(bi)較檢驗進(jin)行統計(ji)分析:* p< 0.05 , ** p< 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001,ns= 非顯著。
(B)在(zai)使用(yong)PHH構建的(de)肝臟芯片的(de)TK6細(xi)胞中(zhong)進行的(de)微(wei)(wei)核(MN)試驗結果(guo)顯示(shi),微(wei)(wei)核水平(% MN頻率)。統計分析(xi)采(cai)用(yong)t檢驗,其(qi)中(zhong) * p< 0.05 , ** p ≤ 0.005, **** p < 0.001。
結論
1.本研究初次報道(dao)了微體系生理(li)學(xue)(MPS)在遺傳毒理(li)學(xue)測(ce)試中的應用(yong)。
2.兩(liang)種生理微環境系統均表現出代謝特性(xing)(xing),并具有在一(yi)個系統內處(chu)理兩(liang)種遺傳毒(du)性(xing)(xing)不(bu)良結果的能力,即誘發染色(se)體損傷(shang)或有絲分裂裝置損傷(shang)(微核試驗)和DNA鏈斷裂(彗星試驗)。
3.本(ben)研究顯示,生理(li)微環境系(xi)統可能是一種有前景的(de)工具(ju),可以(yi)更好地彌補(bu)體內(nei)外研究之(zhi)間的(de)差距,因此(ci)在遺傳毒理(li)學(xue)領(ling)域應進一步探討。
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參考文(wen)獻
(1) Mandon, M., Huet, S., Dubreil, E.,Fessard, V., Le Hegarat, L. Three-dimensional HepaRG spheroids as liver model to study human genotoxicity in vitro with the single cell gel electrophoresis assay. Scientific Reports. 2019; 10548.
(2) Recio, L., Hobbs, C., Caspary, W., Witt, K.L. Dosed-Response Assesment of four genotoxic chemicals in a combined mouse and rat micronucleus and comet assay protocol. J Toxicol Sci. 2010; 35 (2): 149–162.
(3) G. (2013, December 20). File:vector diagram of laboratory mouse (black and white).svg. Retrieved February 16, 2021, from //commons.wikimedia.org/wiki/File:Vector_diagram_of_laboratory_mouse_(black_and_white).svg