發布時間：2024/01/12 點擊數：454 本篇將介紹利用腸-肝微流控器官芯片系統提高口服生物利用度的預測。
本文概況
本研(yan)究(jiu)介紹(shao)了CN-Bio的(de)腸肝(gan)微流控器官芯(xin)片系統（OOC&MPS），使(shi)用數學建模方(fang)法優(you)化實(shi)驗設計，從16種不(bu)同(tong)的(de)化合(he)物(wu)(wu)(wu)選擇了4種藥物(wu)(wu)(wu)進行口(kou)服生物(wu)(wu)(wu)利用度實(shi)驗。與動(dong)物(wu)(wu)(wu)模型相比，MPS預測人體口(kou)服生物(wu)(wu)(wu)利用度的(de)準確性(xing)得到(dao)了改善。這一研(yan)究(jiu)為更具人體相關性(xing)的(de)體外方(fang)法在藥物(wu)(wu)(wu)研(yan)發中的(de)應用提供了潛(qian)在機會，有望提高藥物(wu)(wu)(wu)開發的(de)成功率。
引言
藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)的(de)開發過(guo)程中(zhong)，需(xu)(xu)要理解藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)動力學（PK）特(te)性(xing)，其中(zhong)之一便是生物(wu)(wu)利用度，其定義為藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)在(zai)腸(chang)道吸收和肝(gan)臟首過(guo)代謝后進入體循環的(de)比例。對(dui)于生物(wu)(wu)利用度較低(di)的(de)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)，往往難(nan)以保持在(zai)治(zhi)療窗口內。通常需(xu)(xu)要使用更大劑量才能(neng)達到治(zhi)療效(xiao)果，但這樣做有誘發不(bu)良安全(quan)效(xiao)應的(de)風險，需(xu)(xu)要對(dui)生物(wu)(wu)利用度進行估計，以指導藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)開發過(guo)程，因此其準確性(xing)與(yu)臨床試(shi)驗(yan)的(de)成功或失敗有較大的(de)相關(guan)性(xing)。
口服生物利用度通常使用動物（如狗、大鼠、小鼠和非人類靈長類動物）進行估計，其中狗、大鼠、小鼠和非人類靈長類動物是較常用的。然而，這些物種與人類生物利用度的總體相關性（R2 = 0.34）較弱，正如 Musther 等人的一項重要研究所述，他們調查了184種化合物的生物利用度1。
此外，與動物研究相(xiang)(xiang)關的較高(gao)成本和倫理(li)考慮引發了以下問題(ti)：是(shi)否存在更(geng)(geng)具人體相(xiang)(xiang)關性的體外方法，以獲得更(geng)(geng)準確的口服生物利用(yong)度估計？
微生理系統（MPS），通常(chang)被稱為(wei)(wei)“芯(xin)片上(shang)的(de)器官”（organ-on-a-chip），已成為(wei)(wei)在臨床前(qian)(qian)藥物(wu)(wu)ADME研究中(zhong)獲(huo)得相關人體數據的(de)潛力工具。它們旨在通過在3D支架中(zhong)培養細(xi)胞，并在灌流(liu)條件(jian)下模擬血液流(liu)動，來(lai)復制人體組(zu)(zu)織的(de)結構和功能(neng)特性。到(dao)目前(qian)(qian)為(wei)(wei)止，MPS的(de)發(fa)展主要集中(zhong)在單器官組(zu)(zu)織模型(xing)上(shang)，但(dan)更(geng)復雜的(de)多器官系統正在出現，以滿(man)足改善(shan)體外(wai)到(dao)體內PK預測(ce)的(de)需求(qiu)。對于口服生物(wu)(wu)利用度，需要結合腸肝MPS來(lai)模擬藥物(wu)(wu)在腸道中(zhong)的(de)吸收和隨(sui)后在肝臟中(zhong)的(de)首過代(dai)謝(xie)過程。
研究目標
在這里，我們描述了一種使用PhysioMimix OOC MPS-TL6消耗性培養板來估計人體口服生物利用度的腸-肝MPS。該培養板與CN Bio的PhysioMimix多器官芯片系統設備兼容，由六個獨立孔組成，每個獨立孔內有兩個腔室，分別模擬腸道和肝臟。培養基通過連接通道在各腔室之間循環。腸道MPS由上皮和腺細胞系的混合物組成，形成了Transwell膜內側的屏障。肝臟MPS由原代人肝細胞（PHH）組成，在多孔膠原蛋白涂層支架上形成3D微組織。
通過使用單個MPS-TL6培養板模擬口服和靜脈注射（IV）劑量給藥，進行口服生物利用度的估計。采用數學模型來協助設計和優化實驗方法。
材料與方法
冷凍保存的可培養性原代人肝細胞（PHH）由ThermoFisher購得。每個 MPS-TL6培養板（CN Bio Innovations Ltd）的肝臟隔室中接種了0.6 x 106 PHH，并在含有500 nM羥化可的松（Sigma）的肝細胞維持培養基中進行培養。腸道屏障是由Caco-2/HT-29細胞（ReadyCell）的混合物組成，在肝臟培養（PHH）的第5天之前，在含有血清的腸道培養基中預培養了21天，然后添加到MPS-TL6板中。以下藥物的口服（100μM無血清腸道培養基）和靜脈注射（10 μM肝細胞維持培養基）劑量被制備：阿司匹洛、苯妥英、萘普生和甲基潑尼松。
對于每種藥物，使用一個MPS-TL6培養板來估計生物利用度。六個獨立孔中的三個用于模擬口服給藥方案，剩下的三個用于靜脈注射給藥方案。在第5天，將肝細胞維持培養基（不含藥物）加入口服劑量孔的肝臟和腸道基底腔室。對于靜脈注射孔，藥物被注入肝臟和腸道基底腔室。在更換培養基后，腸道MPS Transwell隨后插入MPS-TL6培養板。對于口服劑量孔，藥物被加入Transwell的頂部。對于靜脈注射孔，無血清腸道培養基（不含藥物）被加入Transwell的頂部。
在0、1、4、6、24和48小時時采集培養基樣本，并通過液相色譜-質譜聯用（LC-MS）分析來確定肝臟隔室中母藥的濃度。使用GraphPad Prism來估算口服和靜脈注射濃度曲線下面積（AUC）。然后，使用以下計算方法估算口服生物利用度：
在第4天和第7天使用P450-Glo CYP3A4酶(mei)活性測(ce)定（Promega）評(ping)估PHH的(de)(de)代謝潛(qian)能。通過測(ce)量跨膜(mo)電阻（TEER）來評(ping)估藥(yao)物給藥(yao)實驗前后的(de)(de)腸(chang)道屏(ping)障穩定性。作為對照，還在24孔培養板中(zhong)以相同的(de)(de)頂部（無血清腸(chang)道培養基(ji)）和底部（肝細胞維持培養基(ji)）培養基(ji)，靜態培養腸(chang)道Transwell，同樣進行了TEER評(ping)估，以與腸(chang)肝實驗進行比較。
藥物的選擇用于通過腸肝MPS估計生物利用度，源自Musther等人的一項關于人體和動物生物利用度比較的研究1。選擇范圍縮小到那些在Transwell上的Caco-2屏障中具有肝細胞清除率和滲透性參考數據的藥物2,3。數學建模需要這兩個輸入參數，我們用它來指導和優化實驗設計。選擇了16種具有生物制藥藥物分布分類系統（BDDCS）1或2類的化合物，其主要代謝途徑是肝臟，用于數學建模。使用R編程語言進行了數學建模，使用常微分方程（ODE）來描述MPS-TL6培養板中隨時間的濃度變化。包RxODE用于在R中模擬ODE4。在這16種藥物中，LogD值小于3的藥物：阿司匹洛、苯妥英、萘普生和甲基潑尼松，被選中用于通過腸肝MPS估計生物利用度。LogD值大于3可能會具有不良的理化藥物特性，如溶解度差和蛋白結合增加，使得估計PK特性更具挑戰性。
使用Maier等人描述的模型5，估算了16種藥物在小腸中的濃度。簡而言之，該模型基于對泊沙康唑的體內研究，該研究在酸性或中性溶液中將40毫克（57μM）的藥物輸送到志愿者的胃中6。十二指腸中的至高濃度分別達到26.3 ± 10.3μM或13.6 ± 5.8μM，相當于將藥物溶解在300毫升水中，吸收率為90%6,7。我們使用這種關系來估算藥物在吸收前后的小腸中的濃度，根據英國國家藥典（BNF）、世界衛生組織解剖治療化學分類（ATC）或醫學專業月刊（MIMS）數據庫中的16種藥物的臨床推薦劑量。
結果與討論
1、MPS-TL6中口服生物利用度的估算
使用PhysioMimix 多器官系統(tong)（圖1A），我們(men)展示了多器官腸(chang)肝(gan)MPS在(zai)體外(wai)估算口服生物利(li)用度的(de)(de)應用。在(zai)這項(xiang)研究(jiu)中，每個(ge)(ge)MPS-TL6培(pei)養(yang)(yang)板的(de)(de)井被(bei)分為兩個(ge)(ge)給藥(yao)方案，以估算口服和靜脈注射(she)劑量后(hou)的(de)(de)藥(yao)物生物利(li)用度（圖1B）。對于口服給藥(yao)，藥(yao)物被(bei)加入(ru)到腸(chang)道MPS的(de)(de)頂部(bu)，而(er)對于靜脈注射(she)，藥(yao)物被(bei)加入(ru)到循環(huan)于腸(chang)道和肝(gan)臟(zang)隔室之間的(de)(de)介質中。在(zai)第5天給藥(yao)，在(zai)原代肝(gan)細胞接種和將腸(chang)培(pei)養(yang)(yang)物插(cha)入(ru)MPS-TL6培(pei)養(yang)(yang)板后(hou)，檢測窗口為48小時（圖1C）。
圖1.MPS-TL6中口服生物利用度的估算
A) MPS-TL6中的流體由PhysioMimix多器官系統控制流動。
B) 為了估計口服生物利用度，藥物被添加為口服劑量，進入腸腔室，或作為靜脈注射劑量，流經MPS-TL6板的肝臟和腸隔室之間的循環介質。
C) 生物利用度估計的實驗時間線。PHH被種植到多孔支架中，在肝隔室內形成3D微組織，第1天更換培養基。在第4天，采集介質樣本，并評估QC指標，以確保功能穩定。在第5天，預培養的腸道Transwell被添加到MPS-TL6板的腸隔室中。隨后通過流體流動將腸和肝隔室連接在一起，然后進行藥物給藥。在48小時內采集樣本，以獲得藥物濃度曲線。
2、口服生物利用度實驗的設計與優化
利用數學建模方法，通過描述MPS-TL6培養板每個隔室中化合物濃度的方程(圖2A)，來協助指導生物利用度實驗的設計。從一項研究中選擇了16種化合物(R2 = 0.32，圖2B)進行數學建模，該研究調查了184種化合物的動物與人體生物利用度(R2 = 0.34)，發現相關性較弱1。數學建模被用于優化多個系統參數，旨在設計一個接近人體生物利用度值的實驗。例如，在MPS-TL6中評估了一系列隔室容積和流速，這些值介于板允許的至小值和至大值之間，還研究了樣本點的時間和頻率，以阿司匹洛為例（圖2C）。模型發現，將研究時間限制在僅6小時，或者在早期時間點進行過少的采樣，將導致生物利用度的估計不準確。
對于口服藥物給藥，我們旨在使用相同的濃度，且該濃度與小腸中的有效藥物濃度相關，相關的濃度會影響避免藥物飽和腸道MPS并可能誘發毒性并導致屏障喪失。使用Maier等人描述的方法，基于藥物的臨床推薦劑量和小腸中的靜息水容積，來估算藥物在腸道的濃度5。我們估計了16種藥物在小腸中的中位數藥物濃度，在吸收前和吸收后分別為659.3 μM和97.2 μM（圖2D）。為了降低藥物引起腸道毒性的可能性，我們選擇了一個相關的口服藥物濃度，即100μM，位于估算的較低端，用于所有生物利用度實驗。為了測試我們的腸肝MPS模型準確預測口服生物利用度的能力，從16種藥物中選擇了LogD值小于3的4種藥物：阿司匹洛、苯妥英、萘普生和甲基潑尼松。
圖2.口服生物利用度實驗的設計與優化
A) 描述MPS-TL6培養板中每個隔室化合物濃度的數學模型示意圖。對16種化合物的口服生物利用度進行了建模。
B) 動物模型對這16種化合物的生物利用度預測較弱1。
C) 運行數學模型以優化腸肝MPS實驗參數，包括更佳采樣時間和采樣頻率。以阿司匹洛為例展示，旨在盡可能接近其已知的人體生物利用度值。
D) 使用Maier等人描述的方法估計16種化合物在吸收前后的小腸中濃度，該方法考慮了每種藥物的臨床劑量和小腸中的靜息體積5。
3、在MPS-TL6培養板中，肝臟和腸道功能的質量控制指標得以維持
生物利用度(du)估(gu)(gu)計(ji)期(qi)間保持了PHH的代謝能力和腸道(dao)屏(ping)障(zhang)的完整(zheng)性(xing)等質量控制(zhi)指標（圖3）。這表明(ming)生物利用度(du)估(gu)(gu)計(ji)是基于功能穩定的體外多器官腸肝(gan)MPS得出的，因此我(wo)們對其準確性(xing)具有信(xin)心。
圖3.在MPS-TL6培養板中，肝臟和腸道功能的質量控制指標得以維持
選擇(ze)了四種化合(he)物進行口(kou)服生(sheng)物利用度實驗：阿司匹洛(luo)、苯妥英、萘(nai)普生(sheng)和甲基潑(po)尼松。
A) 通過P450-Glo CYP3A4酶活性測定對肝臟MPS的代謝能力進行了評估，并在整個研究過程中得以維持。
B) 腸道MPS中的上皮屏障穩定性得以維持，通過在將腸道Transwell添加到MPS-TL6（第5天）和研究結束時（第7天）對TEER進行測量來進行評估。
4、與動物模型相比，MPS-TL6與人體生物利用度的相關性得到了改善
在MPS-TL6培養板中，對這4種藥物的口服和靜脈給藥進行了比較，通過腸道屏障的滲透性和肝臟細胞的清除率，這些是濃度曲線的主要驅動因素（圖4）。觀察到的藥物清除程度與報告的體外非結合內源性清除率2（CLint，u，圖4A）相符。對于阿司匹洛、苯妥英和甲基潑尼松，腸肝MPS對人體生物利用度的預測優于動物模型（圖4B）。對于萘普生，動物模型準確預測生物利用度，而我們的腸肝MPS表現相似（圖4B）。
圖4. 與動物模型相比，MPS-TL6與人體生物利用度的相關性得到了改善
A) 阿司匹洛、苯妥英、萘普生和甲基潑尼松在肝隔室中進行口服和靜脈注射途徑的濃度隨時間變化圖。每種化合物的清除程度與報告的體外非結合內源性清除率（CLint, u）相符。
B) 腸肝MPS顯示對阿司匹洛、苯妥英和甲基潑尼松的人體生物利用度預測有所改善，而萘普生與動物模型的準確預測相當。
C) 與使用動物獲得的值相比，對這四種化合物進行實驗測試后，與人體生物利用度的整體相關性得到了改善。
結論
使用(yong)具有較高(gao)生(sheng)物利(li)用(yong)度(du)值(zhi)的(de)(de)(de)(de)藥(yao)(yao)物，腸(chang)-肝(gan)微生(sheng)理(li)系統（MPS）比(bi)動物模(mo)型(xing)能更準確地(di)預測(ce)人體(ti)生(sheng)物利(li)用(yong)度(du)。對于(yu)4種(zhong)(zhong)測(ce)試(shi)的(de)(de)(de)(de)化(hua)合物中的(de)(de)(de)(de)3種(zhong)(zhong)，腸(chang)-肝(gan)MPS的(de)(de)(de)(de)預測(ce)效(xiao)(xiao)果更好，對于(yu)第4種(zhong)(zhong)，腸(chang)-肝(gan)MPS的(de)(de)(de)(de)預測(ce)效(xiao)(xiao)果與(yu)動物模(mo)型(xing)相似。與(yu)動物實(shi)驗(yan)相關(guan)的(de)(de)(de)(de)倫理(li)和成(cheng)本考慮相比(bi)，這種(zhong)(zhong)體(ti)外方法可以在(zai)不到10天(tian)的(de)(de)(de)(de)時間內(nei)，僅使用(yong)單個(ge)MPS-TL6板來預測(ce)每(mei)種(zhong)(zhong)藥(yao)(yao)物的(de)(de)(de)(de)人體(ti)生(sheng)物利(li)用(yong)度(du)。腸(chang)-肝(gan)MPS有潛力在(zai)藥(yao)(yao)物開(kai)發的(de)(de)(de)(de)早期提供與(yu)人體(ti)相關(guan)的(de)(de)(de)(de)生(sheng)物利(li)用(yong)度(du)進行預測(ce)估(gu)計(ji)，有助于(yu)確保藥(yao)(yao)物在(zai)臨床試(shi)驗(yan)中的(de)(de)(de)(de)成(cheng)功或(huo)防止失敗。
參考文獻
1.Musther, H., Olivares-Morales, A., Hatley, O. J. D., Liu, B. & Hodjegan, A. R. Animal versus human oral drug bioavailability: Do they correlate? Eur. J. Pharm. Sci. 57, 280 (2014).
2.Hallifax, D., Foster, J. A. & Houston, J. B. Prediction of Human Metabolic Clearance from In Vitro Systems: Retrospective Analysis and Prospective View. Pharm. Res. 2010 2710 27, 2150–2161 (2010).
3.Li, C., Liu, T., Cui, X., Uss, A. S. & Cheng, K.-C. Development of In Vitro Pharmacokinetic Screens Using Caco-2, Human Hepatocyte, and Caco-2/Human Hepatocyte Hybrid Systems for the Prediction of Oral Bioavailability in Humans: //dx.doi.org/10.1177/1087057107308892 12, 1084–1091 (2016).
4.W, W., KM, H. & DA, J. A Tutorial on RxODE: Simulating Differential Equation Pharmacometric Models in R. CPT pharmacometrics Syst. Pharmacol. 5, 3–10 (2016).
5.Maier, L. et al. Extensive impact of non-antibiotic drugs on human gut bacteria. Nature 555, 623 (2018).
6.Hens, B., Brouwers, J., Corsetti, M. & Augustijns, P. Supersaturation and Precipitation of Posaconazole Upon Entry in the Upper Small Intestine in Humans. J. Pharm. Sci. 105, 2677–2684 (2016).
7.Mudie, D. M. et al. Quantification of Gastrointestinal Liquid Volumes and Distribution Following a 240 mL Dose of Water in the Fasted State. Mol. Pharm. 11, 3039–3047 (2014).
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