本文主要介紹利用敏感且選擇性的人體肝微生理器官芯片系統和臨床生物標志物評估多種模式藥物引起的肝損傷。

導讀

本文(wen)通過(guo)展(zhan)示CN-Bio微(wei)生理器官芯(xin)片（MPS&OOC）的(de)(de)(de)(de) 3個典(dian)型的(de)(de)(de)(de)藥(yao)(yao)物誘導性肝(gan)損傷（DILI）案例（包括兩組(zu)化合(he)物，一(yi)組(zu)核酸藥(yao)(yao)物ASOs）研究，并(bing)評估了(le)(le)一(yi)組(zu)（13種）已知(zhi)具有臨床DILI風險的(de)(de)(de)(de)行業標準化合(he)物的(de)(de)(de)(de)敏(min)感(gan)性和選擇性，同(tong)(tong)時(shi)使用細胞功能和細胞健康終點創建了(le)(le)一(yi)個獨特的(de)(de)(de)(de)機(ji)制性“肝(gan)毒(du)性標志(zhi)”，展(zhan)示了(le)(le)MPS預測(ce)(ce)(ce)DILI風險的(de)(de)(de)(de)能力(li)，由于該(gai)模(mo)型識(shi)別了(le)(le)在2D和一(yi)些3D體(ti)外模(mo)型中未能檢測(ce)(ce)(ce)到的(de)(de)(de)(de)肝(gan)毒(du)性物質（吡格列酮(tong)、地塞米(mi)松、左氧氟沙星），證明(ming)了(le)(le)CN-Bio的(de)(de)(de)(de)肝(gan)MPS DILI測(ce)(ce)(ce)定方(fang)法在檢測(ce)(ce)(ce)藥(yao)(yao)物誘導肝(gan)毒(du)性方(fang)面比經典(dian)的(de)(de)(de)(de)2D原代(dai)肝(gan)細胞培養、動物模(mo)型具有更高的(de)(de)(de)(de)敏(min)感(gan)性和準確度(du)。總之，本文(wen)展(zhan)示了(le)(le)肝(gan)MPS能準確、可靠(kao)且一(yi)致地識(shi)別具有不同(tong)(tong)DILI風險藥(yao)(yao)物的(de)(de)(de)(de)潛(qian)力(li)。

研究(jiu)背景

肝臟是易受(shou)藥物毒(du)性(xing)(xing)(xing)影響(xiang)的(de)器官之(zhi)一，藥物誘導性(xing)(xing)(xing)肝損傷（DILI）是急性(xing)(xing)(xing)肝衰竭的(de)常見(jian)原因，也(ye)是藥物開發中(zhong)化合物損耗的(de)原因之(zhi)一，已知有超過750種經FDA批(pi)準(zhun)的(de)藥物存(cun)在一定程度的(de)DILI風險[1]，解讀藥物肝毒(du)性(xing)(xing)(xing)的(de)機制仍是一個挑戰。雖然為此(ci)目的(de)開發了許多體外和(he)體內的(de)臨床(chuang)前(qian)模型，但它們都(dou)有其(qi)局限性(xing)(xing)(xing)。例如(ru)，基(ji)因序列或免疫反應(ying)的(de)種間差異意味(wei)著動物模型不適用于人類特異性(xing)(xing)(xing)的(de)藥物模式[2]，而(er)簡單(dan)的(de)體外模型無法(fa)檢(jian)測具有轉化相關生物標志物等(deng)[3]。

在這(zhe)里，本研究評估了CN-Bio的體外人體肝(gan)微生理器(qi)官芯(xin)片(pian)系統（MPS&OOC），也稱為肝(gan)芯(xin)片(pian)（Liver on chip,LOC），是否能(neng)夠(gou)準確預測藥(yao)物(wu)的DILI風險(xian)，其(qi)中包括13種已(yi)知(zhi)的嚴重和輕度(du)肝(gan)毒性的制藥(yao)藥(yao)物(wu)和兩種反義寡(gua)核苷酸（ASO）。肝(gan)MPS先前(qian)已(yi)經顯示(shi)可(ke)以在流動灌注下維持高度(du)功能(neng)的3D肝(gan)小組織(zhi)，長達四(si)周，這(zhe)使其(qi)非常(chang)適(shi)合(he)評估急性和慢性DILI（如下表(biao)）。

通過三個案例研究(jiu)，本(ben)文展(zhan)示了CN Bio的肝(gan)MPS準確(que)識別具(ju)有(you)不同(tong)DILI風險的藥(yao)物(wu)的潛力。為(wei)了提高(gao)該模(mo)型(xing)(xing)的轉(zhuan)化(hua)相關(guan)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)，本(ben)研究(jiu)分析了功能性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)的肝(gan)特異性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)終(zhong)點（包括臨(lin)床生物(wu)標志物(wu)如血清白(bai)蛋白(bai)和丙氨酸氨基(ji)轉(zhuan)移酶，ALT）。最終(zhong)評估了該模(mo)型(xing)(xing)對一組已知具(ju)有(you)臨(lin)床DILI風險的行業標準化(hua)合物(wu)（這些(xie)測試的化(hua)合物(wu)與IQ聯盟敏(min)感性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)清單相匹配，并根據FDA DILIrank數據集以及Proctor等人的研究(jiu)中的DILI嚴重性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)分類進(jin)行了排名（Proctor et al.，Arch Toxicol（2017））的敏(min)感性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)和選擇(ze)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)[4]。

研究目(mu)標

01  展示人類肝(gan)MPS的能力，能夠從15種化(hua)合物(wu)中生成與臨(lin)床相關的高內涵數據（6個終點EC:50曲線）

02  展(zhan)示人體肝MPS通過為兩個ASOs生(sheng)成與臨床(chuang)相關的(de)高內容數(shu)據(ju)（6個端點EC:50曲線），準(zhun)確(que)評估(gu)新型藥(yao)物的(de)DILI風險的(de)能力

03  確(que)定人(ren)類肝MPS是否能夠(gou)比傳統的(de)臨(lin)床前方法更(geng)準確(que)地預測人(ren)類DILI

材料與方法(fa)

使用BioIVT提供的(de)冷凍保存(cun)的(de)原代人(ren)肝細胞(bao) (PHHs)和(he)Lonza購(gou)買的(de)人(ren)庫普弗細胞(bao)(HKCs)。PHHs（0.4 x 106）和(he)HKCs（0.04 x 106）的(de)共培(pei)養(yang)被接種到PhysioMimix Liver（MPS-LC-12）板中(zhong)。細胞(bao)在Advanced DMEM培(pei)養(yang)基、4% Cocktail B和(he)500 nM氫化可的(de)松中(zhong)，在PhysioMimix多器官系統(tong)中(zhong)培(pei)養(yang)了(le)8天。

在(zai)第四天(tian)，使(shi)用(yong)測(ce)試(shi)化合物的(de)(de)7個(ge)(ge)遞(di)增濃度給肝(gan)微組織(zhi)進(jin)行了投(tou)藥(yao)。每48小時(shi)，對(dui)肝(gan)微組織(zhi)進(jin)行一次(ci)(ci)投(tou)藥(yao)，持續8天(tian)。陰(yin)性對(dui)照為含(han)0.1% DMSO的(de)(de)Advanced DMEM維持培(pei)養基，陽性對(dui)照為 100 mM 氯丙嗪(qin)。在(zai)整個(ge)(ge)培(pei)養板上(shang)隨機排列了處理(li)和未(wei)處理(li)的(de)(de)孔，每個(ge)(ge)條件均進(jin)行了三(san)次(ci)(ci)測(ce)試(shi)。

通過ELISA測量了白蛋白的(de)產生（R&D systems），使(shi)用(yong)Cyto-tox96測定(ding)了LDH的(de)釋放（Promega），使(shi)用(yong)QuantiChrom試劑(ji)盒測定(ding)了尿素的(de)合(he)成，使(shi)用(yong)P450-Glo CYP3A4 Assay測定(ding)了CYP3A4的(de)活性(xing)（Promega），ALT活性(xing)則(ze)使(shi)用(yong)Alanine Transaminase Activity Assay kit測定(ding)（Abcam），使(shi)用(yong)CellTiter-Glo 3D Cell Viability assay測定(ding)了細(xi)胞的(de)存活率(lv)（Promega）。

研(yan)究結果

圖1 PhysioMimix OOC使得(de)能(neng)夠(gou)生成3D人體肝微組織(zhi)，可在(zai)功能(neng)上保持長達四周(zhou)的(de)時間(jian)

A）肝體外模型由PhysioMimix OOC微(wei)生(sheng)理系統(tong)生(sheng)成，該(gai)系統(tong)使用專為在工程支(zhi)架中(zhong)以3D方式培養原代肝細胞的開(kai)口孔(kong)板(ban)。

B）PhysioMimix多芯(xin)肝板的示意圖(tu)，其采用(yong)開(kai)口孔設計(ji)，用(yong)于(yu)在工程支架(jia)上進行(xing)PHHs和HKCs的3D共(gong)培養。

C）孔的橫截面，演示了支(zhi)架和(he)3D肝微(wei)組織通(tong)過(guo)微(wei)泵進行的流體流灌注(zhu)。

D）由Liver MPS中(zhong)共培養PHHs和(he)(he)HKCs產生的(de)(de)3D肝(gan)微組織(zhi)的(de)(de)相差顯(xian)(xian)微鏡（10x和(he)(he)20x）和(he)(he)免疫熒光顯(xian)(xian)微鏡（IF）圖。為(wei)了可(ke)視化HKCs，在播種(zhong)HKCs之(zhi)前，HKCs被轉導(dao)為(wei)表達eGFP的(de)(de)腺病毒載體(ti)。顯(xian)(xian)示了代表性(xing)的(de)(de)光顯(xian)(xian)微圖。轉導(dao)和(he)(he)成像是(shi)作(zuo)為(wei)一個獨立的(de)(de)實(shi)驗(yan)(yan)進行(xing)的(de)(de)，以演示細胞(bao)(bao)定位。HKCs細胞(bao)(bao)在用于實(shi)驗(yan)(yan)性(xing)細胞(bao)(bao)培養之(zhi)前須(xu)在內部進行(xing)預驗(yan)(yan)證，且(qie)須(xu)具有低水(shui)平的(de)(de)解凍后活化；這(zhe)是(shi)通過測(ce)量(liang)生物標志物IL-6和(he)(he)TNF-α來評(ping)估的(de)(de)。

圖2 PhysioMimix肝芯片板(ban)中標準DILI測定的實驗時間(jian)表(biao)

首先，圖(tu)3A中呈現的(de)數據(ju)來自15種化合物(wu)測試的(de)過程，顯示出低的(de)組內(nei)和組間變異性，具有良好(hao)的(de)可重(zhong)復性。在培養(yang)8天后，對(dui)健(jian)康對(dui)照微組織進行了多項健(jian)康和肝指標（白蛋(dan)白、尿素、CYP3A4、ATP）的(de)評估，顯示出較高水平(ping)的(de)肝功能和可重(zhong)復性（圖(tu)3B、C）。

圖3 肝MPS產生較高可重復的(de)數據和一致(zhi)的(de)微(wei)組(zu)織

A）第(di)四天的(de)3D肝微組織(zhi)質(zhi)量控制（QC）指標（平均±標準(zhun)差，N = 360）；在藥物給藥結束時(shi)(shi)（96小時(shi)(shi)）的(de)功(gong)能評估。

B）白蛋(dan)白和尿素(su)，以及C）CYP3A4和ATP。數(shu)據來自12個(ge)(ge)獨立(li)實驗；對于每個(ge)(ge)實驗，使用(yong)了三個(ge)(ge)空(kong)載對照復(fu)制品（數(shu)據顯示均值±標準差，N = 36）。

第一項研究

本研(yan)究(jiu)檢查(cha)了一對用(yong)于帕金森病管理(li)的藥物，托(tuo)(tuo)卡(ka)朋(peng)（tolcapone）和恩他卡(ka)朋(peng)（entacapone），兩者(zhe)均被分類為兒茶酚-O-甲基轉移酶（COMT）抑制劑。托(tuo)(tuo)卡(ka)朋(peng)是(shi)第一個批(pi)準(zhun)的COMT抑制劑，于1998年進入美國市場，但(dan)在批(pi)準(zhun)后不(bu)久因導致(zhi)幾(ji)名(ming)患有嚴重(zhong)肝(gan)病的患者(zhe)死亡而被撤(che)回，表明其DILI風險在臨床前安全測試中被忽視，托卡(ka)朋于(yu)2009年(nian)重新引入市(shi)場(chang)，僅用于(yu)帕(pa)金森(sen)病(bing)的治療(liao)。

它的結構類似物恩(en)他(ta)卡朋(peng)是第二個用于(yu)帕金(jin)森病的COMT抑(yi)制(zhi)劑(ji)，肝(gan)毒性風險較低，被認為相對安全，但偶爾可(ke)(ke)能(neng)導致一些肝(gan)損傷(shang)。體(ti)外(wai)細(xi)胞(bao)實驗顯示(shi)這兩(liang)種(zhong)化合物都可(ke)(ke)以劑(ji)量依賴性地誘導線粒體(ti)功能(neng)障礙，或通(tong)過抑(yi)制(zhi)外(wai)流轉運蛋(dan)白(bai)，但僅托卡朋(peng)與免疫(yi)性DILI（iDILI）相關，導致T調(diao)節細(xi)胞(bao)急劇增(zeng)加(jia)，而恩(en)他(ta)卡朋(peng)對這種(zhong)細(xi)胞(bao)沒有影響(xiang)。

經(jing)過(guo)8天培養的肝(gan)微組織的代表性相差(cha)顯(xian)微鏡(jing)觀(guan)察（放大10倍）顯(xian)示，托卡(ka)朋Tolcapone引起的肝(gan)損傷(shang)（肝(gan)微組織破損）成劑量依賴性。

圖4 肝微組織(zhi)對托卡(ka)朋（tolcapone）和其結(jie)構相似(si)但(dan)毒(du)性較小的藥物恩他卡(ka)朋（entacapone）的處理反(fan)應

經過8天培(pei)養的肝(gan)微組織的代表(biao)性相差(cha)顯微鏡觀察（放大10倍）。比例尺(chi)= 350微米(mi)。

托卡朋（tolcapone）引起清晰的(de)急(ji)性(xing)毒性(xing)反應，由Cmax驅動，通過臨床生物(wu)標志(zhi)物(wu)ALT和LDH釋放（4.7倍(bei)(bei)Cmax）檢測到，并且在大約5倍(bei)(bei)Cmax時迅速(su)減少(shao)了(le)白(bai)蛋白(bai)和尿素的(de)產(chan)生（圖5）。各(ge)測試終點均捕獲到了(le)慢性(xing)暴露，尤其是在白(bai)蛋白(bai)方面，僅為0.3倍(bei)(bei)Cmax。

細(xi)胞終點（CYP活(huo)性(xing)(xing)和ATP含量）進(jin)一步證實了tolcapone的毒性(xing)(xing)，兩個測定(ding)方法的EC:50值相(xiang)似（表(biao)1）。同時，該模型未檢(jian)測到使用托卡朋(peng)（tolcapone）的非毒性(xing)(xing)結構類似物恩他卡朋(peng)（entacapone）的急(ji)性(xing)(xing)和慢性(xing)(xing)毒性(xing)(xing)效應（圖(tu)4、5，表(biao)1）。

圖(tu)5 利用多種肝毒性終點確定托卡(ka)朋（tolcapone）和恩他卡(ka)朋（entacapone）的(de)藥(yao)物誘(you)導肝損傷（DILI）風險(xian)

肝微組織暴露于托卡(ka)(ka)朋(peng)（綠(lv)色）和恩(en)他卡(ka)(ka)朋(peng)（棕色）96小(xiao)時(shi)。陽性(xing)對照為100 μM氯丙嗪。較高內容(rong)終點(dian)測量均來自相(xiang)同(tong)的肝MPS培養。顯示的數據為平均值(zhi)±標準差(cha)，N = 3，所有數據均來自96小(xiao)時(shi)樣本(ben)，LDH釋(shi)放數據是在48小(xiao)時(shi)測得(de)的。

表1 從人肝(gan)微(wei)組(zu)織中獲取(qu)的(de)托(tuo)卡朋（tolcapone）和恩他卡朋（entacapone）毒性的(de)較高內涵數據(ju)

肝微組織(zhi)暴(bao)露于這2種化合物96小時(shi)。LDH數據(ju)在給藥后(hou)48小時(shi)測(ce)(ce)得(de)。所(suo)顯示的(de)(de)數據(ju)來(lai)自(zi)7點劑量(liang)反應，每個濃度的(de)(de)N = 3。托卡朋(peng)的(de)(de)至高測(ce)(ce)試濃度= 6.3xCmax，恩他卡朋(peng)的(de)(de)至高測(ce)(ce)試濃度= 91.5xCmax。

第二個(ge)研究

本研究提供了兩種抗糖尿病噻唑烷二酮的數據，曲格列酮（troglitazone）和吡格列酮（pioglitazone）。曲格列酮被分類為嚴重DILI，于1997年獲得許可用于治療2型糖尿病，但僅在3年后由于在后市場監測中報告的肝損傷，包括急性肝衰竭而被FDA撤回。此外，迄今為止，已發表的動物研究未能預測曲格列酮可能導致嚴重肝損傷的潛力。這種化合物的毒性也未能在標準的體外2D肝細胞毒性實驗中檢測到。吡格列酮是一種已知的低DILI的化合物，由于肥胖或心力衰竭患者在市場上使用，很少發生急性肝損傷，但偶爾會在后市場中報告，然而在其開發過程中，吡格列酮在經典的體外2D初級肝細胞培養或更先進的3D模型中并未引起任何肝毒性。

MPS中(zhong)投(tou)放曲(qu)格列(lie)酮（troglitazone） 96小(xiao)時的(de)(de)(de)肝(gan)(gan)微(wei)組織(zhi)引(yin)起(qi)了急性(xing)毒(du)性(xing)反(fan)應，由Cmax驅動(dong)，通(tong)過(guo)ALT和(he)(he)(he)LDH釋(shi)放檢測(ce)到，并且(qie)在大(da)約15倍Cmax時迅速減少(shao)了白蛋白和(he)(he)(he)尿(niao)素(su)的(de)(de)(de)產生(sheng)（圖6）。在96小(xiao)時曝露后，對細胞終點(dian)（ATP含量）和(he)(he)(he)CYP3A4活性(xing)（用于評(ping)估代謝轉化(hua)）進(jin)行了采(cai)樣(yang)，進(jin)一(yi)步證實了曲(qu)格列(lie)酮引(yin)起(qi)的(de)(de)(de)毒(du)性(xing)，并且(qie)EC:50值與其他(ta)終點(dian)非常相似（表2）。迄今為止，已發(fa)表的(de)(de)(de)動(dong)物(wu)研究(jiu)未能預測(ce)troglitazone引(yin)起(qi)嚴重肝(gan)(gan)損傷的(de)(de)(de)潛力。此外，這種化(hua)合物(wu)的(de)(de)(de)毒(du)性(xing)也未在標準的(de)(de)(de)體(ti)外2D肝(gan)(gan)臟試驗(yan)中(zhong)檢測(ce)到。

吡格列(lie)酮(tong)（pioglitazone）是一種被認為具有低DILI風險(xian)的(de)化合物，在經典的(de)2D初級肝(gan)(gan)細胞培養(yang)中不表現出肝(gan)(gan)毒(du)性，甚至在一些更先進的(de)3D模型中也(ye)沒有。在大約25倍Cmax時觀察到輕度肝(gan)(gan)毒(du)性效應，表現為白(bai)蛋(dan)白(bai)和尿素產生的(de)適度減(jian)少（圖(tu)6）。在高濃度的(de)吡格列(lie)酮(tong)下，還觀察到ATP含量的(de)輕微減(jian)少，但(dan)這并不顯.著（圖(tu)6）。這些結果表明，肝(gan)(gan)MPS能夠檢測到具有輕度DILI風險(xian)的(de)化合物的(de)毒(du)性。

圖6 肝(gan)MPS準確地(di)生成了(le)曲(qu)格列酮（troglitazone，高DILI）和(he)吡格列酮（pioglitazone，低DILI）的DILI概況，使用多種肝(gan)毒(du)性(xing)終點(dian)

在(zai)MPS中(zhong)，肝微組織暴露于(yu)曲格列酮(tong)(tong)（藍色(se)）和吡格列酮(tong)(tong)（棕色(se)）96小時。各終(zhong)點測量(liang)均來(lai)自同一(yi)肝MPS培養(yang)。所(suo)示數據為平均值±標準偏差，N=3，全部來(lai)自96小時樣(yang)品(pin)。

表2 3D人體肝MPS微組(zu)織中曲格(ge)列(lie)酮（troglitazone，高DILI）和(he)吡格(ge)列(lie)酮（pioglitazone，低DILI）的毒性

MPS中的(de)肝微組織暴露于(yu)兩(liang)種化合物96小時(shi)。所示數據來(lai)自7點劑量(liang)反應，每個濃度(du)N = 3。曲(qu)格列酮的(de)最.大測試濃度(du)= 47 x Cmax，吡格列酮的(de)至高測試濃度(du)= 100 x Cmax。

第三(san)個(ge)研究

研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)探討了(le)CN Bio的(de)(de)(de)(de)肝(gan)MPS預測(ce)兩種（未批準的(de)(de)(de)(de)）ASO，LNA32和(he)LNA43的(de)(de)(de)(de)DILI風險(xian)的(de)(de)(de)(de)能力(li)，這(zhe)兩種ASO在(zai)小(xiao)鼠(shu)和(he)大鼠(shu)體內(nei)模(mo)型(xing)中分別顯示安(an)全和(he)嚴重肝(gan)毒(du)性。ASO是經過(guo)設計的(de)(de)(de)(de)含有(you)鎖定核(he)酸酸（LNA）的(de)(de)(de)(de)工程分子，旨在(zai)誘導靶(ba)RNA裂解。許(xu)多(duo)研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)表(biao)明(ming)，ASO的(de)(de)(de)(de)LNA gapmer的(de)(de)(de)(de)序列內(nei)容與(yu)肝(gan)毒(du)性之(zhi)間(jian)存在(zai)強烈的(de)(de)(de)(de)關聯，而(er)肝(gan)是ASO介導毒(du)性經常觀察到的(de)(de)(de)(de)累積靶(ba)器官之(zhi)一。在(zai)藥物開發(fa)的(de)(de)(de)(de)早(zao)期階段(duan)，進(jin)行體外(wai)代謝研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)對于(yu)預測(ce)ASO的(de)(de)(de)(de)潛在(zai)肝(gan)毒(du)性至關重要，并確保更具人(ren)體相關性的(de)(de)(de)(de)體外(wai)模(mo)型(xing)可實現更高的(de)(de)(de)(de)臨(lin)床試驗升(sheng)級速(su)度。

實驗結(jie)果表明，肝(gan)(gan)(gan)MPS模(mo)型(xing)區分了(le)安(an)全和(he)有(you)毒(du)的(de)(de)(de)(de)ASO（LNA32 - 體(ti)(ti)內(nei)(nei)安(an)全，LNA43 - 體(ti)(ti)內(nei)(nei)嚴重(zhong)肝(gan)(gan)(gan)毒(du)性(xing)(xing)(xing)），并在(zai)96小時(shi)曝露(lu)后僅通過臨(lin)床生物(wu)標(biao)志物(wu)ALT和(he)LDH釋放就檢測(ce)到急性(xing)(xing)(xing)毒(du)性(xing)(xing)(xing)反應(ying)（圖7）。有(you)趣的(de)(de)(de)(de)是(shi)，更簡單(dan)的(de)(de)(de)(de)體(ti)(ti)外人(ren)(ren)(ren)體(ti)(ti)細(xi)胞培養(yang)模(mo)型(xing)未能(neng)檢測(ce)到LNA43的(de)(de)(de)(de)肝(gan)(gan)(gan)毒(du)性(xing)(xing)(xing)（未顯示的(de)(de)(de)(de)數據(ju)）。我(wo)(wo)們(men)(men)假設肝(gan)(gan)(gan)小組(zu)織(zhi)中存(cun)在(zai)的(de)(de)(de)(de)肝(gan)(gan)(gan)免(mian)疫細(xi)胞（HKCs）對該試(shi)(shi)驗的(de)(de)(de)(de)增強靈敏性(xing)(xing)(xing)至(zhi)關(guan)重(zhong)要。盡管我(wo)(wo)們(men)(men)的(de)(de)(de)(de)發現(xian)重(zhong)現(xian)了(le)在(zai)小鼠(shu)和(he)大(da)鼠(shu)模(mo)型(xing)上進(jin)(jin)行(xing)的(de)(de)(de)(de)體(ti)(ti)內(nei)(nei)試(shi)(shi)驗的(de)(de)(de)(de)發表數據(ju)，但我(wo)(wo)們(men)(men)建議在(zai)使用人(ren)(ren)(ren)體(ti)(ti)特異(yi)(yi)性(xing)(xing)(xing)藥物(wu)時(shi)，采用MPS模(mo)型(xing)進(jin)(jin)行(xing)補(bu)充，以確認(ren)體(ti)(ti)內(nei)(nei)動物(wu)研(yan)究的(de)(de)(de)(de)數據(ju)是(shi)否符合預(yu)測(ce)的(de)(de)(de)(de)人(ren)(ren)(ren)體(ti)(ti)反應(ying)。這種(zhong)方法減少(shao)了(le)由于種(zhong)間差異(yi)(yi)導(dao)致的(de)(de)(de)(de)假陽性(xing)(xing)(xing)報告(gao)的(de)(de)(de)(de)風險。總(zong)之，這些發現(xian)重(zhong)現(xian)了(le)在(zai)小鼠(shu)和(he)大(da)鼠(shu)模(mo)型(xing)上進(jin)(jin)行(xing)的(de)(de)(de)(de)體(ti)(ti)內(nei)(nei)試(shi)(shi)驗中的(de)(de)(de)(de)已發表數據(ju)，但更相關(guan)的(de)(de)(de)(de)體(ti)(ti)外人(ren)(ren)(ren)體(ti)(ti)模(mo)型(xing)需要重(zhong)申動物(wu)研(yan)究結(jie)果也(ye)能(neng)預(yu)測(ce)人(ren)(ren)(ren)體(ti)(ti)對藥物(wu)的(de)(de)(de)(de)響應(ying)，以排(pai)除由于種(zhong)間差異(yi)(yi)導(dao)致的(de)(de)(de)(de)假陽性(xing)(xing)(xing)升級到臨(lin)床的(de)(de)(de)(de)可能(neng)性(xing)(xing)(xing)。

圖7 肝(gan)(gan)MPS準確確定了兩種(zhong)ASO（LNA43，LNA32）的(de)DILI風險(xian)，使(shi)用多種(zhong)肝(gan)(gan)毒性終點

MPS中的肝微組織暴露于LNA43（藍(lan)色(se)）和(he)LNA32（棕色(se)）96小(xiao)時(shi)。各終點測量均來自(zi)同一肝MPS培養中。所示數據(ju)為(wei)平(ping)均值±標準(zhun)偏差(cha)，N = 3，均來自(zi)96小(xiao)時(shi)樣本。

對于13種化(hua)合(he)物(wu)，計算EC:50與總血漿Cmax的(de)(de)比值，即校正曝(pu)露(lu)的(de)(de)細胞(bao)毒性(xing)(xing)，然后繪制成(cheng)“安(an)全閾(yu)值”(MOS)。在(zai)圖 8中，繪制所有測(ce)(ce)試化(hua)合(he)物(wu)在(zai)96小時曝(pu)露(lu)時的(de)(de)MOS值。測(ce)(ce)試的(de)(de)化(hua)合(he)物(wu)顯(xian)示在(zai)水平軸(zhou)上，從(cong)左(zuo)側的(de)(de)低(di)DILI嚴重性(xing)(xing)到右側的(de)(de)嚴重DILI關注，排列(lie)有序。在(zai)50倍MOS值的(de)(de)固定閾(yu)值下，通過比較由EC:50或(huo)MOS閾(yu)值確定的(de)(de)DILI陽性(xing)(xing)/陰性(xing)(xing)狀(zhuang)態與每(mei)種化(hua)合(he)物(wu)的(de)(de)已知DILI狀(zhuang)態，評(ping)估(gu)了測(ce)(ce)定方法的(de)(de)敏感性(xing)(xing)和(he)特異性(xing)(xing)。

數(shu)(shu)據(ju)表明，與尿素、ATP和ALT相比，白蛋白是更為敏(min)感的測定(ding)指標，因(yin)為它在為所有測試化合物生成的多數(shu)(shu)終(zhong)點(dian)劑量-響應曲線中檢測到了(le)毒性(xing)，但總體而言，四個測定(ding)顯(xian)示出MOS和DILI嚴重(zhong)(zhong)性(xing)之(zhi)間(jian)非(fei)常(chang)好的相關性(xing)（未顯(xian)示數(shu)(shu)據(ju)，應用指數(shu)(shu)趨勢(shi)線，相關系數(shu)(shu)（R2）范(fan)圍從0.90到0.99）。白蛋白突顯(xian)了(le)MOS值與DILI嚴重(zhong)(zhong)性(xing)之(zhi)間(jian)的趨勢(shi)，數(shu)(shu)據(ju)證(zheng)明了(le)肝(gan)(gan)MPS DILI測定(ding)方法在檢測藥(yao)物誘導肝(gan)(gan)毒性(xing)方面比經典的2D原代肝(gan)(gan)細(xi)胞培養(yang)具(ju)有更高(gao)的敏(min)感性(xing)。

圖8 MPS DILI試驗準確(que)確(que)定了一系列已知(zhi)的(de)重度(du)和輕度(du)肝毒性化合物的(de)潛(qian)在風險

根(gen)據暴露校正的(de)細胞(bao)毒性或安全邊際（MOS = EC:50/Cmax），在暴露后96小時測(ce)(ce)定(ding)了(le)四個(ge)關(guan)鍵生(sheng)物標(biao)志物白(bai)蛋白(bai)、尿素、ATP和臨床(chuang)生(sheng)物標(biao)志物ALT。所有終點測(ce)(ce)量均來自同一肝MPS培(pei)養中。所示數(shu)據為平(ping)均值±標(biao)準偏差，N = 3。測(ce)(ce)試的(de)化合物根(gen)據DILI等級從(cong)低DILI關(guan)注度(du)（左(zuo)側）到高DILI關(guan)注度(du)（右側）排列。這些測(ce)(ce)試的(de)化合物與(yu)IQ聯(lian)盟敏感(gan)性清(qing)單相匹(pi)配，并根(gen)據FDA DILIrank數(shu)據集以及Proctor等人的(de)研究中的(de)DILI嚴重(zhong)性分類進(jin)行了(le)排名(ming)（Proctor et al.，Arch Toxicol（2017）91:2849–2863，DOI 10.1007/s00204-017-2002-1）。

結論

本文各(ge)數據數據和實驗方法表明，CN Bio的(de)肝臟MPS模型可以(yi)可靠且一致地產(chan)生具有更高肝功能和新(xin)(xin)陳代謝活躍(yue)的(de)肝小(xiao)組(zu)織(zhi)。這些肝小(xiao)組(zu)織(zhi)可以(yi)在DILI篩選中常規使用，準(zhun)確(que)預測(ce)新(xin)(xin)化(hua)合物的(de)潛在風險，并有以(yi)下幾個結論：

1、通過使(shi)用臨床相關的(de)(de)生物(wu)標(biao)志(zhi)物(wu)，CN Bio的(de)(de)肝臟微生理系統（Liver MPS）提供了更好的(de)(de)體外到體內的(de)(de)轉(zhuan)化能力

2、肝(gan)臟(zang)微生理系統準確預(yu)測了一系列不同方式的(de)(de)化合物已(yi)知的(de)(de)藥物性(xing)肝(gan)損傷(shang)（DILI）

3、肝臟微生理(li)系統補充了動物研究的使用(yong)，以幫助確(que)認或查詢安全數(shu)據預測[5]

4、肝臟微生理系統預測(ce)了曲(qu)格列酮（troglitazone）的上市后DILI風險

5、通過改善在早期階段預(yu)測DILI風險(xian)的能(neng)力，肝臟微生理系統(tong)可能(neng)更(geng)好地保護患者的生命，并(bing)為藥物發現公司節省更(geng)大成本

主要參考(kao)文(wen)獻

1. Lisi, D. M. Drug-induced liver injury: An overview. US Pharmacist. 41 (12), 30–34 (2016).

2. Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies. Current Drug Metabolism. 9 (1), 1–11 (2008).

3. Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line HepG2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism and Disposition. 31 (8), 1035–1042 (2003).

4. Baudy, A. R. et al. Liver microphysiological systems development guidelines for safety risk assessment in the pharmaceutical industry. Lab Chip 20, 215–225 (2020).

5. Proctor, W. R. et al. Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 91 (8), 2849–2863 (2017).