發布時間：2022/10/28 點擊數：723 介(jie)紹
Caco-2細胞（人類結腸腺癌）單層培養是一個公認的行業標準的體外模型，用于預測藥物通過腸屏障的滲透性1。藥物滲透性在臨床前藥物研究中確定，是開發新療法時的一個重要參數，因為它對達到系統循環的口服藥物的量有影響。標準Caco-2模型由接種在靜態培養皿中的多孔Transwell膜上的單層細胞組成，該膜將兩個流體腔室（頂部和底部外側）分隔開，Caco-2細胞形成極化上皮，具有緊密連接，在腔室之間形成屏障。
盡管廣泛使用Caco-2 Transwell模型，但也存在公認的局限性。與人類小腸（50-100Ω/ cm2)2相比，Caco-2模型的跨上皮電阻（TEER）值通常高出一個數量級(1400-2000Ω/ cm2)。此外，Caco-2模型未能再現小腸的細胞多樣性，僅表現為上皮成分。
近年(nian)來，人(ren)(ren)們一(yi)直在(zai)努力改(gai)進(jin)臨床前藥物(wu)開(kai)發和(he)疾病研究中(zhong)(zhong)使用(yong)(yong)的體外模(mo)型(xing)，尤其(qi)是微生理(li)系(xi)統（MPS），也稱為芯片上的器官(guan)（OOC）的使用(yong)(yong)越(yue)來越(yue)廣泛。MPS旨在(zai)更好地體現人(ren)(ren)體組織(zhi)和(he)器官(guan)系(xi)統的結構和(he)功能特征。這是通過灌注細胞培(pei)養(yang)基來模(mo)擬組織(zhi)中(zhong)(zhong)的血(xue)流，在(zai)3D支(zhi)架中(zhong)(zhong)培(pei)養(yang)細胞和(he)/或使用(yong)(yong)多(duo)種細胞類型(xing)來更好地反映細胞多(duo)樣性來實現的。通過利用(yong)(yong)MPS創建更多(duo)轉化相關模(mo)型(xing)，有(you)機(ji)會改(gai)進(jin)用(yong)(yong)于(yu)預(yu)測藥物(wu)滲透性的體外腸道模(mo)型(xing)。
目的
在這(zhe)里，我們描述了(le)腸(chang)(chang)道MPS的特征，并證明了(le)其預測(ce)藥(yao)物滲(shen)透(tou)性(xing)的實用性(xing)。使用 CN Bio的PhysioMimix單器(qi)官系統(tong)培養(yang)MPS模型(xing) ，將上皮細(xi)胞（Caco-2）和(he)杯狀(zhuang)細(xi)胞（HT29-MTX）的混合物暴露于持續的液體(ti)流(liu)中，產生(sheng)形態和(he)功能的改(gai)變。我們計劃研究液體(ti)流(liu)動和(he)細(xi)胞多樣(yang)性(xing)對(dui)腸(chang)(chang)屏(ping)障完整性(xing)的影響(xiang)，目的是建立一個更接近人類小腸(chang)(chang)的腸(chang)(chang)通透(tou)性(xing)的MPS模型(xing)。
材(cai)料和方法
Caco-2和HT29-MTX細(xi)胞(bao)(bao)取自ECACC，并在(zai)(zai)(zai)標(biao)準(zhun)DMEM中(zhong)(zhong)培(pei)養（外加10%FCS、1% 青霉素/鏈霉素、1%NEAAs和1%GlutaMAX）。對于Gut MPS模(mo)(mo)型，Caco-2/HT29-MTX 細(xi)胞(bao)(bao)以3：1 的(de)比例(li)在(zai)(zai)(zai)基(ji)底側(ce)接種（PET Transwell insert，孔徑0.4 um，Corning），總細(xi)胞(bao)(bao)數為50000個/孔。對于靜態模(mo)(mo)型，僅在(zai)(zai)(zai)基(ji)底側(ce)播種50000個Caco-2細(xi)胞(bao)(bao)/孔。在(zai)(zai)(zai)轉移(yi)到(dao)PhysioMimix OOC MPS-T12板中(zhong)(zhong)培(pei)養18~25 天之(zhi)前，腸道(dao)MPS最初(chu)在(zai)(zai)(zai)靜態24孔板中(zhong)(zhong)培(pei)養1天 (Figure 1)。在(zai)(zai)(zai)更(geng)換培(pei)養基(ji)之(zhi)前，每(mei)隔2-3天進行一次TEER測量，以評(ping)估(gu)屏障的(de)形成/完整(zheng)性，使(shi)用帶STX2 chopstick探針的(de)EVOM3 伏特計。
在屏障形成充分(>100Ω/cm2)后，評估熒光素黃在腸道屏障中的轉運情況。在補充的Hank平衡鹽溶液（HBSS）緩沖液中，在24孔板中進行轉運研究，將200μM熒光素黃添加到基底側腔室中，并在30、60、120和180分鐘采集頂部樣品，然后在熒光酶標儀中進行分析。
在(zai)Trizol試(shi)劑(ji)（Invitrogen）中收(shou)集細胞，并(bing)使用(yong)Trizol和和RNA純(chun)化試(shi)劑(ji)盒（Invitrogen）遵循制(zhi)造商(shang)的說明從每個(ge)樣(yang)(yang)品中提取RNA。根據制(zhi)造商(shang)的流程，使用(yong)帶有RNase抑制(zhi)劑(ji)（Applied Biosystems）的High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit逆轉(zhuan)錄(lu)試(shi)劑(ji)盒合成互補DNA（cDNA）。通(tong)過RT-PCR對cDNA樣(yang)(yang)本進行緊密連接（TJ）蛋白定量。
用TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)進(jin)(jin)行實(shi)(shi)時聚合酶鏈反應（RT-PCR）分析(xi)。通過編碼(ma)3-磷酸(suan)甘油醛(quan)脫氫酶（GAPDH）的管家基因的表達來量(liang)化樣(yang)本。使(shi)用Applied Biosystems Quant flex studio 6軟件對(dui)結果進(jin)(jin)行分析(xi)。所有實(shi)(shi)驗均在三個(ge)(ge)重復孔中進(jin)(jin)行，并(bing)至少重復三次。通過比較恒定(ding)熒光強度下的定(ding)量(liang)循環（Cq）值，對(dui)每個(ge)(ge)樣(yang)品的數據進(jin)(jin)行分析(xi)。
對于成像，細胞被移除并在+4°C的4%多聚甲醛（PFA）中固(gu)(gu)定(ding)過夜。然后在固(gu)(gu)定(ding)切片和(he)石蠟(la)包埋樣品(pin)中測定(ding)粘蛋白-2（MUC2）和(he)Zonula occludens-1 (ZO-1) 的免疫熒光信號。
對于免疫(yi)熒光成(cheng)像，用磷酸鹽緩沖鹽（PBS）中(zhong)的10%牛(niu)血(xue)清白(bai)蛋白(bai)（BSA）飽和Transwell膜(mo)10分鐘，并(bing)用抗(kang)(kang)(kang)ZO1和抗(kang)(kang)(kang)MuC2單克隆(long)抗(kang)(kang)(kang)體在+4°C下孵(fu)育過(guo)夜。然后將樣品與二(er)抗(kang)(kang)(kang)孵(fu)育1小(xiao)時。其(qi)中(zhong)抗(kang)(kang)(kang)羊免疫(yi)球蛋白(bai)G（IgG），耦聯Alexa Fluor（594）（Invitrogen）用于ZO-1；抗(kang)(kang)(kang)兔IgG，耦聯Alexa Fluoro（488）（Invitrogen，）用于MuC2。將膜(mo)與Aqua Poly/Mount抗(kang)(kang)(kang)褪色溶液(ye)封(feng)裝在玻片上，在尼康(kang)EclipseTi熒光顯微鏡下觀(guan)察。
石蠟(la)包埋切片(pian)脫蠟(la)并(bing)(bing)浸泡濃(nong)度降(jiang)低(di)的(de)一系列醇。將(jiang)載(zai)玻片(pian)在(zai)室溫下封閉1小時，并(bing)(bing)在(zai)+4°C下在(zai)抗(kang)MUC2和抗(kang)ZO-1抗(kang)體中孵育過夜。然(ran)后(hou)將(jiang)載(zai)玻片(pian)用含0.1%吐溫-20的(de)PBS沖(chong)洗(xi)三(san)次，每(mei)次5分鐘(zhong)，并(bing)(bing)用二(er)抗(kang)羊免疫球蛋白G(IgG) (耦聯Alexa Fluor (594) (Invitrogen)，用于(yu)ZO-1，以及二(er)抗(kang)兔IgG(耦聯AlexaFluoro(488)，(Invistrogen)，用于(yu)MuC2，孵育1小時。載(zai)玻片(pian)在(zai)隨后(hou)的(de)清洗(xi)程序后(hou)包埋，并(bing)(bing)在(zai)尼康(kang)Eclipse Ti熒光(guang)顯微鏡下進行檢查。
為了進(jin)行藥物(wu)滲透性評(ping)估，在(zai)(zai)(zai)二甲基亞砜（DMSO）中制備Atenolol, Verapamil-HCL 和Furosemide母液(ye)，并(bing)在(zai)(zai)(zai)補充的(de)HBSS緩(huan)沖(chong)液(ye)中稀釋至(zhi)工作濃度200μM。在(zai)(zai)(zai)將(jiang)200μM的(de)適當化合物(wu)添加到Transwell的(de)基底外(wai)側隔室(shi)之前，將(jiang)Transwell轉移到24 孔板中的(de)靜態培養條件下(xia)，并(bing)在(zai)(zai)(zai)HBSS緩(huan)沖(chong)液(ye)中孵育30分鐘。樣品在(zai)(zai)(zai)30、60、120和180分鐘時進(jin)行頂部采(cai)集(ji)，并(bing)在(zai)(zai)(zai)發送給(gei)Sygnature Discovery進(jin)行LC-MS分析之前 立即(ji)儲(chu)存在(zai)(zai)(zai)-80°C下(xia)。N=每種(zhong)藥物(wu)3個Transwell。
結果
Figure 1. 腸道MPS概述
A. TEER評估腸道MPS和Caco-2培(pei)養物的屏障完整性，第7天后每(mei)隔2-3天讀取一次讀數
B. 板中的液體流動由PhysioMimix單器官系統控制
C. 上皮屏(ping)障(zhang)(zhang)需要18天(tian)才(cai)能形成，TEER用于(yu)評(ping)(ping)估(gu)屏(ping)障(zhang)(zhang)強度。腸道模型可用于(yu)第18至25天(tian)的實(shi)驗，以評(ping)(ping)估(gu)藥物化合物的滲(shen)透性、流量等參數(shu)。
Figure 2. 腸(chang)道MPS顯(xian)示復雜的三(san)維形態和生理(li)相關屏(ping)障
A . 通過(guo)TEER評(ping)估腸道MPS和(he)Caco-2培養物(wu)的屏障完整性，在第(di)7天(tian)后每隔2-3天(tian)讀取一次讀數。
n=每個實驗2-4個培(pei)養物。Error bars=standard deviation.
B. 在兩個獨立的實驗(yan)中(zhong)，在第18 天(tian)和第25天(tian)測量的腸道(dao)MPS的熒光素(su)黃的表觀滲透系數(Papp)，并與(yu)Caco-2靜態(tai)培 養物(wu)進行(xing)比較。
n=每個(ge)實驗(yan)2-4個(ge)培養物。Error bars=standard deviation.
C. 用qPCR檢測(ce)腸道MPS和Caco-2靜態培(pei)養物中(zhong)緊密連接基因的表達，并(bing)用?Ct表示。
n=每個實驗2-4個培養物。Error bars= standard deviation.
D. 腸道MPS和Caco-2靜態培養物石蠟包埋切(qie)片的組(zu)織學分(fen)析，用蘇木精/伊紅(hong)染(ran)色(se)(se)或通過免疫熒光顯示(shi)緊(jin)密連接形成（ZO-1，紅(hong)色(se)(se)）、粘蛋白生成細胞的表(biao)達(da)（MUC2，綠色(se)(se)）和核定位染(ran)色(se)(se)(DAPI，藍色(se)(se))。
n=每個實驗(yan)2-4個培養物。
Figure 3. 腸道MPS表達緊密連接(jie)和粘液
腸(chang)道(dao)MPS和(he)Caco-2靜態培養物的代(dai)表性圖(tu)像染色顯(xian)示(shi)緊密連接形(xing)成（ZO-1，紅 色）、粘蛋(dan)白生成細(xi)胞的表達（MUC2，綠色）和(he)核定位染色（DAPI，藍色）。
Figure 4. 與靜態(tai)Caco-2培養物相比，腸道MPS提高了藥(yao)物滲透性的預測能力(li)
通過定量LC-MS測定腸道MPS和Caco-2靜態培養物中verapamil, atenolol, 和furosemide 的Papp，并與人體生物利用度進行比較3。
討論
使用PhysioMimix單器官系統培養(yang)腸道(dao)MPS，及其功能特(te)征和(he)形態(tai)與標準靜(jing)態(tai)Caco-2模(mo)型進行(xing)比較(jiao)。在腸道(dao)MPS中(zhong), 內皮(pi)細胞(bao)和(he)杯狀(zhuang)腸細胞(bao)的混合物(wu)(wu)被接種到Transwell的基(ji)底外側，并直接暴(bao)露(lu)于循環(huan)培養(yang)基(ji)中(zhong) (Figure 1A)。流體流動(dong)由PhysioMimix單器官系統控制（Figure 1B）培養(yang)物(wu)(wu)維(wei)持長(chang)達25天，分析窗口(kou)在第18天和(he)第25天之間（Figure 1C）。
與靜態Caco-2培養相比，腸道MPS的屏障完整性顯著降低，并且更接近于在人體小腸中觀察到的生理相關值 (50-100 Ω/cm2)2 (Figure 2A)。當在第18天和第25天單獨測試時，屏障完整性的降低轉化為熒光素黃的較低滲透系數（Papp） (Figure 2B)。此外，與靜態Caco-2培養物相比，腸道MPS模型的轉錄物顯示與緊密連接相關的基因表達較低 (Figure 2C)。結合熒光素黃的Papp和TEER測量結果，表明腸道MPS屏障不太緊密，滲透性更強，因此符合體內觀察結果。
組(zu)織學分(fen)析(xi)表明(ming)，靜態Caco-2細胞(bao)在(zai)Transwell膜上形成(cheng)一個單(dan)層(ceng)細胞(bao) (Figure 2D)。相比(bi)之下，含有Caco-2和HT29-MTX細胞(bao)混合物(wu)的(de)(de)腸道MPS暴露于連續的(de)(de)流體流中(zhong)，組(zu)織深(shen)度增加，表明(ming)分(fen)化為具有潛在(zai)吸收功能的(de)(de)成(cheng)熟腸細胞(bao) (Figure 2D)。此(ci)外(wai)，熒光顯微(wei)鏡顯示(shi)了模型中(zhong)杯狀(zhuang)細胞(bao)的(de)(de)作用，其誘導MUC2的(de)(de)表達，是小腸粘(zhan)液屏障(zhang)的(de)(de)基本組(zu)成(cheng)部分(fen)(Figure 3)。
在腸(chang)(chang)道(dao)MPS和標準Caco-2模型(xing)中(zhong)測定了具有不同人體(ti)體(ti)內生(sheng)物(wu)(wu)利(li)用(yong)度(du)3的(de)(de)三種(zhong)探針化(hua)合(he)物(wu)(wu)的(de)(de)滲(shen)透性(xing)(xing) (Figure 4)。腸(chang)(chang)道(dao)MPS能夠確(que)定所有化(hua)合(he)物(wu)(wu)的(de)(de)腸(chang)(chang)道(dao)通透性(xing)(xing)值(zhi)，每種(zhong)化(hua)合(he)物(wu)(wu)都具有不同的(de)(de)性(xing)(xing)質(Figure 4)。Furosemide 和atenolol 腸(chang)(chang)道(dao)MPS中(zhong)的(de)(de)滲(shen)透性(xing)(xing)較低，與體(ti)內生(sheng)物(wu)(wu)利(li)用(yong)度(du)數(shu)據相(xiang)關性(xing)(xing)良好，而(er)靜態Caco-2相(xiang)比與體(ti)內呈(cheng)負相(xiang)關 (Figure 4)，很快被吸(xi)收(shou)，兩種(zhong)模型(xing)之間大致相(xiang)似(Figure 4)。
總之，動(dong)態(tai)共培養(yang)腸(chang)道(dao)(dao)MPS被證(zheng)明顯示了一個(ge)具有復雜三維形態(tai)、屏障完整性降低和粘液表達的(de)更(geng)具生(sheng)理相關性的(de)腸(chang)道(dao)(dao)模型。與標準靜(jing)態(tai)Caco-2模型相比，腸(chang)道(dao)(dao)MPS顯示出更(geng)強的(de)通透性，并且與受試(shi)藥物(wu)的(de)人體內生(sheng)物(wu)利用度有更(geng)好(hao)的(de)相關性。
通過培養原代細胞或干細胞衍生的腸細胞，可以進一步改進模型。此外，腸道MPS可以集成到CN Bio的PhysioMimix多器官系統中，與原代肝細胞共同培養，在單個實驗板中研究腸-肝串擾以及聯合藥物吸收和代謝4。
參考文獻
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