發布時間：2022/11/09 點擊數：628 一、簡介
InSphero Akura PLUS 懸滴培養(yang)(yang)系統(tong)包含Akura PLUS Hanging Drop Plate (“PLUS Plate”) （圖(tu)1左）和Akura 96 Spheroid Microplate（圖(tu)1右(you)）兩個(ge)組件。PLUS Plate中形(xing)成(cheng)的(de)懸滴有助于(yu)增殖較慢或成(cheng)球困難的(de)細(xi)胞的(de)3D細(xi)胞模型的(de)構建和測(ce)試。當(dang)在顯微鏡下觀察到細(xi)胞形(xing)成(cheng)微球之后即可將(jiang)細(xi)胞微球轉移至(zhi)96微球培養(yang)(yang)板(ban)中繼(ji)續培養(yang)(yang)并進行測(ce)試實(shi)驗(yan)。微球培養(yang)(yang)板(ban)獨特的(de)SureXchange換液平臺(tai)可以(yi)簡便地實(shi)現(xian)更溫和、更徹底的(de)培養(yang)(yang)基交換。Akura系列培養(yang)(yang)板(ban)中產(chan)生(sheng)的(de)細(xi)胞微球大小均勻，適用(yong)(yong)于(yu)開展高通量、高重(zhong)復、高可靠性的(de)測(ce)試實(shi)驗(yan)，并能(neng)廣泛(fan)兼容(rong)多種終點分(fen)析(xi)和生(sheng)化分(fen)析(xi)以(yi)及大多數高分(fen)辨率的(de)細(xi)胞成(cheng)像應用(yong)(yong)。
圖1 InSphero Akura PLUS 懸滴(di)培養系統結構示意圖
二、HCT116的(de)細胞3D模型構建(jian)
以下實驗(yan)方(fang)案(an)描述了使(shi)用InSphero Akura PLUS 懸滴培養系統生成3D腫瘤微球的實驗(yan)方(fang)法，旨在(zai)為成功開展(zhan)實驗(yan)提(ti)供(gong)詳細(xi)的指導，并(bing)提(ti)高(gao)首次使(shi)用產品的體驗(yan)。本方(fang)案(an)包(bao)括了培養板的準備、單細(xi)胞(bao)懸液的制備、細(xi)胞(bao)懸滴制備、細(xi)胞(bao)懸滴轉移、換液操作以及建議的質量控制步驟。
01、實驗(yan)材料(liao)
? 凍存(cun)的HCT-116細(xi)胞（人結(jie)腸癌細(xi)胞系(xi)：ATCC，CCL-247）
? 適(shi)宜的(de)細胞培(pei)養基
? T75細胞(bao)培(pei)養瓶（Greiner，658175）
? InSphero Akura PLUS Hanging Drop System
? 無(wu)菌PBS緩沖液(ye)（無(wu)鈣鎂離子）（Sigma-Aldrich，D1408）
? 胰酶(mei)
? 70%乙醇
? 血球計數板(ban)
? 水浴鍋（設置在37℃）
? 血清移(yi)液管（5ml和10ml）
? 離心機(ji)
? 一級生物(wu)安全柜
? 二氧(yang)化碳培養箱（設置在(zai)5% CO2濃度和(he)37℃）
? 倒置顯(xian)微鏡
? 15ml無菌(jun)離心管(guan)
? 多通道移(yi)液器、適配的無(wu)菌(jun)吸頭、無(wu)菌(jun)試(shi)劑槽
02、HCT-116細胞(bao)的擴(kuo)增
注意(yi)：所(suo)有實驗步(bu)驟遵照(zhao)無菌操作(zuo)規范(fan)在生物(wu)安全(quan)柜中操作(zuo)。
1. 確保(bao)所有(you)細胞培養基標記清晰并(bing)在正確的條件下(xia)存放。
2. 將培養(yang)基預(yu)熱(re)至(zhi)37℃。
3. 向T75中加入5ml預(yu)熱(re)的培養基。
4. 在水浴鍋中快速融化細胞。
5. 使(shi)用血清移(yi)液(ye)管吸取5ml預熱(re)的培養基，并于融(rong)化的細胞(bao)混(hun)合，將混(hun)勻液(ye)轉移(yi)至(zhi)15ml離心管中。
6. 室(shi)溫下(xia)離心，200 RCF 2min，棄(qi)去(qu)上清液，并(bing)用5ml預熱培養基重懸細胞。
7. 將細胞(bao)轉移至T75中。
8. 將T75轉(zhuan)移至二氧化(hua)碳培養(yang)箱中(zhong)。
9. 培養24h后，更換(huan)培養基，并在顯微鏡(jing)下檢(jian)查細胞(bao)貼附(fu)情況。
10. 當(dang)細胞達到70-80%交匯度時（約48h）可(ke)以用(yong)于下游的細胞微球培養(yang)。
03、制(zhi)備單細胞(bao)懸(xuan)液
1. 將培養基預(yu)熱至37℃。
2. 將(jiang)T75從二氧化碳培養箱中取出，使(shi)用血清移液管棄去培養基。
3. 向T75中加入10ml的(de)PBS。
4. 輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)搖(yao)晃(huang)培(pei)養瓶(ping)后(hou)棄去PBS。
5. 加入(ru)1ml的胰(yi)酶(mei)（1x），于(yu)37℃孵育5min。
6. 加入(ru)9ml的完全(quan)培養基（含FBS）終止(zhi)消化。
7. 將細胞液轉(zhuan)移至(zhi)15ml離(li)心管。
8. 室(shi)溫下離心，200 RCF 2min，棄去上清液，并用適量（取(qu)決于細胞壓積）預(yu)熱培養基重懸細胞。
9. 使(shi)用血球計數(shu)器（或其他細胞技術(shu)方法）進(jin)行計數(shu)。
10. 調(diao)整細胞密度至12500cells/ml（即(ji)500 cells/40μl）。
04、3D細胞模(mo)型的構(gou)建-懸(xuan)滴(di)形成
1. 拆開包裝(zhuang)之前(qian)，用70%乙醇擦(ca)拭Akura PLUS板袋(dai)；
2. 無(wu)菌條件下(xia)打開袋子，取出Akura PLUS板(ban)；
3. 向直徑15cm的培養基中加(jia)(jia)入20ml 濃度為0.5% 的PBS溶液，將加(jia)(jia)濕(shi)墊(dian)放入0.5%PBS中浸濕(shi)（約(yue)5min）。
4. 將加濕墊放入(ru)到(dao)加濕槽(cao)中(zhong)，并加入(ru)12ml的(de)0.5% PBS。
5. 每孔加(jia)入40ul細胞懸液(ye)（圖2左）；輕微施加(jia)壓力使確(que)保(bao)吸頭尖端(duan)與PLUS板孔入口緊(jin)密(mi)接觸（圖2右），以確(que)保(bao)液(ye)體完全轉移和保(bao)證懸滴(di)的均一(yi)性。
圖(tu)2 在Akura PLUS板中(zhong)制備懸滴
6. Akura PLUS板放置在5% CO2，37℃恒溫孵(fu)育箱中(zhong)培養。
注(zhu)意：請(qing)小(xiao)心移動Akura PLUS板，以避免懸滴滴落。
7. 通過(guo)加濕墊的(de)切(qie)口(kou)定期評估球(qiu)狀(zhuang)體(ti)的(de)形成(cheng)(cheng)情況。圖3a，3b，3c分別展示了(le)細(xi)胞接種(zhong)30min，1d和(he)3d時(shi)球(qiu)狀(zhuang)體(ti)的(de)生長(chang)狀(zhuang)態。大約(yue)4天(tian)后，大多數細(xi)胞都能在懸滴中形成(cheng)(cheng)細(xi)胞微球(qiu)。
圖3 不同時間點球狀體的形成情況
05、細胞微球(qiu)轉移
為了(le)長期培養(yang)(yang)和實驗(yan)分析，需要把懸滴從Akura PLUS板中轉移至Akura 96孔微(wei)球培養(yang)(yang)板中進行培養(yang)(yang)。
? Akura 96 Spheroid Microplate預濕潤
注意事項(xiang)：在使(shi)用前(qian)對Akura 384孔(kong)(kong)微球(qiu)培養(yang)板(ban)進(jin)行預濕(shi)潤操作(zuo)，可以有(you)效避免孔(kong)(kong)內氣泡(pao)的產生。
以下操(cao)作均在(zai)無菌(jun)環(huan)境下進行：
① 將40ul含(han)FCS或BSA的細胞系培養基(ji)小心加入到insphero 384微(wei)球培養板的每(mei)個孔中，注意吸頭尖端(duan)不要觸及到孔的底部。
② 輕(qing)輕(qing)上下移液孔中的介質（該過程(cheng)需避免產生氣泡）。
③ 緩慢移除介(jie)質。
? 細胞微球轉移
① 利于設(she)計的(de)栓孔(kong)結構（圖4）將Akura PLUS板放置(zhi)在(zai)Akura 96孔(kong)微球培養板上(shang)，此時Akura PLUS板上(shang)的(de)懸(xuan)滴將會與Akura 96孔(kong)微球培養板上(shang)的(de)孔(kong)完全對應。
圖4 InSphero 96孔(kong)微球培養(yang)板栓孔(kong)結構
Note：綠色(se)箭頭所(suo)指的是微球培養(yang)板的Akura PLUS板精確結(jie)合的固定孔，Akura PLUS板上(shang)設有位置對(dui)應(ying)的栓結(jie)構。
② 通(tong)過Akura PLUS板的孔(kong)入(ru)口(kou)緩慢加入(ru)70ul完全(quan)培(pei)養(yang)基（≤10ul/sec），吸頭尖端與孔(kong)的入(ru)口(kou)接觸(chu)并施(shi)加輕微壓力，將懸滴轉移(yi)到Akura 96孔(kong)微球(qiu)培(pei)養(yang)板中（如(ru)圖5）。
③ 通過導(dao)致顯(xian)微鏡(jing)觀察來(lai)驗(yan)證微球(qiu)轉移。
④ 微(wei)(wei)(wei)球(qiu)轉移后，將Akura 96孔微(wei)(wei)(wei)球(qiu)培養板放(fang)置在(zai)微(wei)(wei)(wei)孔板離心機中，在(zai)250rcf條件下(xia)離心2min，是(shi)細(xi)胞微(wei)(wei)(wei)球(qiu)沉(chen)降到孔的底部，并清除(chu)氣泡。
⑤ 為了確保每個孔中培(pei)養基的體積(ji)的準確性，可以先將孔的培(pei)養基去除(chu)，并重新加入70ul新鮮培(pei)養基。
圖5 細胞微球Akura PLUS板轉移至Akura 96微球培養板
⑥將Akura 96微球培養(yang)板放入5%CO2,37℃恒溫(wen)培養(yang)箱中(zhong)繼續培養(yang)。
06、培養基更換
InSphero Akura 96微(wei)球(qiu)(qiu)培(pei)養板獨特的(de)孔(kong)結構可以實現(xian)高(gao)效、便捷的(de)換液操作，同(tong)時可以有(you)效避免微(wei)球(qiu)(qiu)損失和微(wei)球(qiu)(qiu)丟失。培(pei)養基更換流(liu)程(cheng)如圖(tu)6所示。
① 將(jiang)(jiang)吸頭(tou)尖(jian)端放置在(zai)孔(kong)邊(bian)緣(yuan)的平臺上，以≤30ul/sec的移液(ye)速(su)度緩慢吸出孔(kong)中(zhong)的培(pei)養基(ji)(ji)；孔(kong)中(zhong)將(jiang)(jiang)會有5-7ul的培(pei)養基(ji)(ji)殘留；
② 將吸頭尖端放在(zai)孔邊緣的平臺上(shang)，以≤50ul/sec的移液速度緩慢加入(ru)新鮮培養基。
③ 將(jiang)Akura 96微球(qiu)培養(yang)板(ban)放入5%CO2，37℃恒(heng)溫培養(yang)箱(xiang)中繼續培養(yang)。
圖6 Akura 96微球培養板培養基換液流程
說明：本(ben)文內容僅介紹InSphero Akura PLUS懸滴(di)培(pei)養系統(tong)在進行3D細胞模型構建應用中操作過程的介紹，不包(bao)含結果(guo)分析(xi)。對(dui)結果(guo)分析(xi)感(gan)興趣的讀(du)者可以參考以下資源和文章(zhang)：
1、P. Beauchamp, et al., Development and Characterization of a Scaffold-Free 3D Spheroid Model of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Human Cardiomyocytes, Tissue Eng., Part C, 2015, 21(8), 852–861
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