發布時間：2023/01/13 點擊數：709 近年來，CAR-T/NK細胞(bao)免(mian)疫(yi)療法在實(shi)體瘤(liu)治(zhi)療研究領域中(zhong)非常(chang)火熱。隨著細胞(bao)免(mian)疫(yi)治(zhi)療的興(xing)起(qi)也推動了(le)(le)實(shi)體瘤(liu)研究的發展，但(dan)是由于人源化體系(xi)的復雜性、免(mian)疫(yi)系(xi)統的部分或無效重組建等問題，致使免(mian)疫(yi)腫瘤(liu)模(mo)型面臨(lin)(lin)著巨(ju)大的挑戰，臨(lin)(lin)床上迫切需要能(neng)夠用于個體化驗證療效的體外(wai)模(mo)型。細胞(bao)微(wei)球為細胞(bao)免(mian)疫(yi)治(zhi)療在實(shi)體瘤(liu)中(zhong)的研究提供了(le)(le)新(xin)的契(qi)機。然而，現有(you)的細胞(bao)微(wei)球培養(yang)方法中(zhong)有(you)許多限制因素阻礙了(le)(le)腫瘤(liu)細胞(bao)微(wei)球與免(mian)疫(yi)細胞(bao)充分接觸(chu)。
InSphero 3D微(wei)球(qiu)(qiu)培養板為(wei)獲得大小(xiao)均一的(de)腫瘤(liu)細(xi)胞(bao)(bao)微(wei)球(qiu)(qiu)提供了新的(de)解決方案(an)(an)，同時為(wei)細(xi)胞(bao)(bao)微(wei)球(qiu)(qiu)與(yu)免疫(yi)細(xi)胞(bao)(bao)共培養提供一種新的(de)選擇。本(ben)文中小(xiao)編(bian)將為(wei)大家(jia)分享一篇(pian)腫瘤(liu)細(xi)胞(bao)(bao)微(wei)球(qiu)(qiu)與(yu)免疫(yi)細(xi)胞(bao)(bao)共培養的(de)解決方案(an)(an)。
肺腫瘤(liu)細胞微球與PBMC細胞免疫共培養解決方案(an)
01- 試劑耗材
? 凍存的A549–GFP/hDF細(xi)胞
? 適(shi)宜的細胞培養基
? T75細胞培(pei)養瓶（Greiner，658175）
? InSphero Akura 96/384 Spheroid Microplate
? 無(wu)菌PBS緩沖液（無(wu)鈣鎂(mei)離子）
? 胰酶
? 70%乙醇
? 血球計數(shu)板(ban)
? 水浴鍋（設置在37℃）
? 血(xue)清移液管（5ml和10ml）
? 離心機
? 一級(ji)生物(wu)安全柜(ju)
? 二氧化(hua)碳(tan)培(pei)養(yang)箱（設置在5% CO2濃度和(he)37℃）
? 倒置顯(xian)微(wei)鏡
? 15ml無菌離心(xin)管
? 多通道移液器、適(shi)配的無(wu)菌(jun)吸頭、無(wu)菌(jun)試(shi)劑槽(cao)
02- 細(xi)胞擴增
注(zhu)意(yi)：所有(you)實驗步驟遵照無菌操作(zuo)規范(fan)在生物(wu)安全柜中操作(zuo)。
1、確保(bao)所有(you)細(xi)胞培養基標記清(qing)晰并在正確的條(tiao)件下存放(fang)。
2、將培養基(ji)預(yu)熱(re)至37℃。
3、向T75中加(jia)入(ru)5ml預熱(re)的培養基。
4、在水浴鍋中快速融化細胞。
5、使用血清移(yi)液管吸取5ml預熱的(de)培養(yang)基，并于融化的(de)細胞混合(he)，將(jiang)混勻液轉(zhuan)移(yi)至(zhi)15ml離心管中。
6、室溫下離(li)心，200 RCF 2min，棄去上清液(ye)，并用5ml預熱(re)培養基重懸細胞。
7、將(jiang)細胞轉(zhuan)移(yi)至T75中。
8、將T75轉移(yi)至二氧化碳培養箱中。
9、培(pei)養24h后，更換(huan)培(pei)養基，并在顯微鏡下檢(jian)查細(xi)胞貼附情況(kuang)。
10、當(dang)細胞達到70-80%交匯(hui)度時（約48h）可以用于下游的細胞微球培養。
03- 細胞懸液(ye)制(zhi)備
1. 將培(pei)養基預(yu)熱至37℃。
2. 將T75從二氧(yang)化碳培養(yang)箱中取出(chu)，使用血清(qing)移(yi)液管棄去培養(yang)基。
3. 向T75中(zhong)加(jia)入10ml的PBS。
4. 輕輕搖晃(huang)培養(yang)瓶后(hou)棄去PBS。
5. 加入(ru)1ml的胰酶（1x），于37℃孵育5min。
6. 加入9ml的(de)完(wan)全培(pei)養基（含FBS）終止消化。
7. 將(jiang)細胞液轉移至15ml離心管(guan)。
8. 室溫下離(li)心，200 RCF 2min，棄去上清(qing)液，并(bing)用適量（取決(jue)于(yu)細胞壓積）預熱培養(yang)基重(zhong)懸細胞。
9. 使用血球計數器(qi)（或其他細胞(bao)技術方法）進行計數。
10. 調整細胞密度至(zhi)12500cells/ml（即500 cells/40μl）。
04- 細胞微(wei)球構建(jian)及培養（圖1）
圖(tu)1 Akura 96孔微球培(pei)養板的使用流(liu)程
1、使(shi)用70%乙(yi)醇擦(ca)拭Akura培養(yang)板的外(wai)包(bao)裝，并在生物安(an)全柜(ju)中取出Akura培養(yang)板。
2、將單細胞懸(xuan)液轉移至試(shi)劑槽中，使用移液器輕(qing)輕(qing)吹(chui)打(da)細胞懸(xuan)液以保證濃度均一。
3、使用(yong)多通道移(yi)液器或自動化工作站將細胞種(zhong)植(zhi)至Akura培(pei)養(yang)板，每孔70μl。
4、蓋(gai)(gai)上板蓋(gai)(gai)，室溫下離(li)心，250 RCF 2min。
5、將(jiang)培養(yang)板轉(zhuan)移至濕(shi)潤的二氧化(hua)碳培養(yang)箱(xiang)中，并保持斜(xie)立(li)（與水平面夾角30度(du)，圖1）。此過(guo)程(cheng)可(ke)以(yi)使用InSphero專門設計的Akura斜(xie)立(li)支(zhi)架（圖2，InSphero，CS-10-002-00）或將(jiang)培養(yang)板的一側(ce)墊高。
圖2 Akura斜(xie)立支架（InSphero，CS-10-002-00）
05- 細胞微球與PBMC共培養
1. 用初始直徑約為250μm的A549-GFP/hDF細(xi)胞微球與免疫(yi)細(xi)胞進行共培養(yang)。
2. PBMC細(xi)胞(bao)按照制造(zao)商說明書進行復蘇；
3. PBMC用anti-CD3（5ng/ml）和anti-CD28（250ng/ml）預處理(li)24h；或不(bu)做處理(li)（T-cell-na?ve）。
4. 抗(kang)體預孵育的(de)PBMC使用A549–GFP/hDF完(wan)全(quan)培養基洗滌3次；
5. PBMC在A549–GFP/hDF完全(quan)培養基中穩定培養24h；
6. PBMC用10 μg/mL的CellTracker Deep Red dye（cat. no. C34565）在37℃條(tiao)件(jian)下染色1h；
7. A549–GFP/hDF細胞微球(qiu)與PBMC在insphero 384微球(qiu)培養(yang)板中共培養(yang)（10:1 E:T rate）；
8. 使用3D活(huo)細胞(bao)成像(xiang)設(she)置監測腫瘤微組織內的(de)免疫細胞(bao)的(de)浸潤39小時。
06- 結果
肺(fei)癌細(xi)(xi)胞腫(zhong)瘤微(wei)球與免疫細(xi)(xi)胞共培養的活細(xi)(xi)胞成像結(jie)果(guo)(guo)如(ru)圖3所示，其(qi)中(zhong)紅色(se)(se)為免疫細(xi)(xi)胞；綠色(se)(se)為A549-GFP/hDF細(xi)(xi)胞；該研(yan)究中(zhong)對No PBMCs、na?ve PBMCs、Activated PBMCs三個(ge)實驗(yan)組分別選取(qu)0、4h和37h三個(ge)時間點進(jin)行分析。結(jie)果(guo)(guo)表明(ming)Activated PBMCs在(zai)37h時可以有(you)效殺(sha)死A549腫(zhong)瘤微(wei)球中(zhong)的細(xi)(xi)胞。
圖3 3D肺癌模(mo)型中免疫(yi)細胞浸潤的活細胞成像
07- 結論
InSphero微(wei)(wei)球培(pei)養(yang)(yang)板(ban)(ban)是為3D細(xi)胞(bao)(bao)模型的(de)常(chang)規(gui)生(sheng)成和長期培(pei)養(yang)(yang)而設計的(de)。超低吸(xi)附(fu)材質(zhi)制備(bei)的(de)孔(kong)(kong)底可以確保細(xi)胞(bao)(bao)微(wei)(wei)球在(zai)生(sheng)長過(guo)程中不會粘附(fu)在(zai)板(ban)(ban)底部。Insphero微(wei)(wei)球培(pei)養(yang)(yang)板(ban)(ban)在(zai)進行(xing)細(xi)胞(bao)(bao)微(wei)(wei)球培(pei)養(yang)(yang)時，通(tong)過(guo)在(zai)每個孔(kong)(kong)中接種相同(tong)數量的(de)腫(zhong)瘤細(xi)胞(bao)(bao)，可以為免疫(yi)細(xi)胞(bao)(bao)共(gong)培(pei)養(yang)(yang)提供良好一(yi)致性的(de)細(xi)胞(bao)(bao)微(wei)(wei)球。此(ci)外，Insphero微(wei)(wei)球培(pei)養(yang)(yang)板(ban)(ban)特殊的(de)孔(kong)(kong)結(jie)構為細(xi)胞(bao)(bao)微(wei)(wei)球和免疫(yi)細(xi)胞(bao)(bao)提供了更加擁擠的(de)微(wei)(wei)環(huan)境，使免疫(yi)細(xi)胞(bao)(bao)與(yu)腫(zhong)瘤細(xi)胞(bao)(bao)充分接觸(chu)以達到較(jiao)好的(de)殺傷效果。
參考文獻
[1] Wardwell-Swanson J,Suzuki M,Dowell K G,et al. A Framework for Optimizing High-Content Imaging of 3D Models for Drug Discovery:[J]. SLAS Discovery,2020,25(7):709-722.
