發布時間：2022/12/23 點擊數：874 前言
細(xi)(xi)胞治療(liao)用制劑(ji)產(chan)品(pin)需(xu)要專(zhuan)門的(de)(de)處理(li)以(yi)確保它(ta)們成功地從(cong)制造設(she)施轉(zhuan)移運輸到患者身邊。為了提供物流靈活性，目前(qian)的(de)(de)許多(duo)商業化模式都采用了冷(leng)凍(dong)(dong)細(xi)(xi)胞產(chan)品(pin)交付(fu)給醫院(yuan)診所(suo)并存(cun)儲的(de)(de)形式，然(ran)后根據需(xu)求(qiu)解凍(dong)(dong)并注入患者體內(nei)。然(ran)而解凍(dong)(dong)后許多(duo)類型細(xi)(xi)胞的(de)(de)活力(li)和(he)擴增能力(li)都受到冷(leng)凍(dong)(dong)過程帶來的(de)(de)影(ying)(ying)響，統稱為延遲(chi)性細(xi)(xi)胞死(si)亡(DOCD)，因(yin)而最終治療(liao)劑(ji)量的(de)(de)療(liao)效(xiao)和(he)效(xiao)率直接受到低(di)溫(wen)細(xi)(xi)胞保存(cun)關(guan)鍵(jian)工藝參(can)數(shu)的(de)(de)影(ying)(ying)響。所(suo)以(yi)了解低(di)溫(wen)保存(cun)對細(xi)(xi)胞的(de)(de)影(ying)(ying)響對細(xi)(xi)胞療(liao)法的(de)(de)成功商業制造至關(guan)重要。
本文(wen)研究者(zhe)在Jurkat T細(xi)(xi)胞模(mo)型中研究了一(yi)些關鍵(jian)過程參(can)數(CPPs)對解凍(dong)后細(xi)(xi)胞存活率和(he)增殖功能(neng)的影響。研究結(jie)果表明，在Biolife冷(leng)凍(dong)培養基配方的生物保存操作背景下，其他(ta)看(kan)似不(bu)(bu)重要(yao)和(he)不(bu)(bu)相關的通(tong)常(chang)可能(neng)被忽(hu)視的工(gong)藝(yi)參(can)數，也會對解凍(dong)后的細(xi)(xi)胞活力和(he)增殖產生重大影響。
圖-細(xi)胞治療制劑制造中超低溫(wen)保存的關(guan)鍵過程(cheng)步驟
超低溫保存的(de)關鍵過程步驟與其緊接(jie)著的(de)細(xi)胞培養處理結束(shu)前后的(de)制造(zao)工藝(yi)(yi)重疊(die)，因此(ci)細(xi)胞低溫凍存過程直(zhi)接(jie)影(ying)響細(xi)胞治(zhi)(zhi)療(liao)制造(zao)工藝(yi)(yi)以及(ji)治(zhi)(zhi)療(liao)劑量的(de)療(liao)效和效率。
01- 實驗(yan)方法(fa)
· 細胞培養
Jurkat(克隆E6-1)在完全生長培(pei)養基(CGM)中培(pei)養
· 低溫保(bao)存培養基(ji)/凍存液
本(ben)研(yan)究使用兩種主(zhu)要類型的低溫培養基(ji)：
(1) 實驗室自制(zhi)款（HB組）：用(yong)10% w/v溶解人血清白蛋白于(yu)勃脈力A(PlasmaLyte-A)中，并添加(jia)5%二(er)甲(jia)亞砜(DMSO)制(zhi)備(bei)且使(shi)用(yong)前(qian)進行無(wu)菌過濾;
(2) GMP制造的無(wu)血清(qing)和無(wu)蛋白(bai)CryoStor CS5(含(han)5%DMSO)。
· 低(di)溫保存細胞(bao)流程
將(jiang)Jurkat T細胞微球懸(xuan)浮在(zai)指定(ding)的低溫培養(yang)(yang)基中(zhong)，放(fang)置在(zai)2ml 凍存(cun)(cun)管(guan)中(zhong)，并(bing)在(zai)2-8℃下(xia)孵育(yu)15分(fen)鐘，然后(hou)將(jiang)凍存(cun)(cun)管(guan)轉(zhuan)移(yi)到無LN2-程序降(jiang)溫儀(yi)以-1℃/分(fen)鐘的速(su)度冷凍保存(cun)(cun)。在(zai)達到-70℃后(hou)，將(jiang)樣品轉(zhuan)移(yi)到LN2儲存(cun)(cun)至(zhi)少24小時。樣品在(zai)指定(ding)條件下(xia)解(jie)凍，用完全培養(yang)(yang)基(1:10稀釋)重懸(xuan)，轉(zhuan)移(yi)到37℃和5%的CO2培養(yang)(yang)箱。
· 低溫保存關鍵過程參數 CPPs
對比(bi)了標(biao)準凍(dong)存(cun)液的凍(dong)存(cun)過程與自制凍(dong)存(cun)液備選方案(an)針(zhen)對一些不確定(ding)變量(liang)/易被忽視的參數(shu)值進行比(bi)較，如下所示：
· 活力和(he)擴增功能
在NucleoCounter NC-3000成像細(xi)胞(bao)儀上(shang)使用Via-1試劑盒，根據(ju)膜完整性評估立(li)即(ji)解凍(dong)以及解凍(dong)后(hou)24小(xiao)時內的細(xi)胞(bao)存活率和計數。
· 統計(ji)分析(xi)
對(dui)于所(suo)有測量(liang)數(shu)據(ju)，使(shi)用(yong)3-11個獨立實驗(yan)的(de)平均(jun)值統(tong)計(ji)，并(bing)歸一化到預(yu)凍結條件。通過(guo)Tukey校正和p<0.05設定先驗(yan)，然(ran)后通過(guo)雙(shuang)向方差分析(xi)對(dui)各組進(jin)行(xing)統(tong)計(ji)學(xue)意義分析(xi)。
02- 實驗結果(guo)
圖1 - 解凍后(hou)24小時內(nei)使用膜完整性測定進行評估Jurkat T細胞(bao)活力
圖2 - 使(shi)用(yong)膜完整性試驗評估(gu)了解凍后Jurkat T細胞的(de)可(ke)見復(fu)蘇率和擴增性能。
1- 成核
解凍(dong)(dong)后立即檢測(ce)對于成核和(he)非(fei)成核樣品的活率和(he)回收率沒有顯著差(cha)異(yi)。然(ran)而在解凍(dong)(dong)后24小時的隨訪分析中顯示(shi)，無核樣品的存(cun)活率和(he)增殖能力(li)顯著下降。這(zhe)種(zhong)負面影響在無論(lun)哪種(zhong)類型的凍(dong)(dong)存(cun)培養基(自制(zhi)凍(dong)(dong)存(cun)液或CryoStor CS5)都(dou)是觀察到的，不過自制(zhi)組的組間差(cha)異(yi)性(以SD表示(shi))比CS5冷凍(dong)(dong)組大。
2- 稀釋
解(jie)凍(dong)后在(zai)冷培(pei)養基中稀(xi)釋導(dao)致(zhi)Jurkat T細(xi)胞(bao)的活力顯著下降和增殖緩慢。這(zhe)可(ke)能(neng)是由于(yu)DMSO在(zai)低溫(wen)下從細(xi)胞(bao)中緩慢去除，導(dao)致(zhi)滲透細(xi)胞(bao)腫脹(zhang)，導(dao)致(zhi)細(xi)胞(bao)直接裂解(jie)或觸(chu)發凋亡級聯。當(dang)在(zai)溫(wen)暖(nuan)的培(pei)養基中稀(xi)釋時(shi)，這(zhe)種(zhong)對(dui)細(xi)胞(bao)的負面影響將最(zui)小化。
3- 解凍后休息(xi)
與解(jie)凍(dong)后(hou)(hou)立即稀釋的(de)做法相比(bi)，在稀釋成完全生長培養(yang)基之前在冷凍(dong)培養(yang)基中休息(xi)1小時對Jurkat T細(xi)胞(bao)的(de)活(huo)力和增殖的(de)影響最小。休息(xi)期間的(de)溫度(du)似乎(hu)對試驗(yan)結(jie)果沒(mei)有顯(xian)著影響，表(biao)明解(jie)凍(dong)后(hou)(hou)1 h的(de)穩定性由兩種冷凍(dong)培養(yang)基支持。
4- 細胞密度
無論是(shi)5 M/mL還(huan)是(shi)50 M/mL冷(leng)(leng)凍(dong)保存，與使用(yong)標準CPPs冷(leng)(leng)凍(dong)保存的(de)細胞(bao)相(xiang)比，Jurkat T細胞(bao)立即或解凍(dong)后24小時的(de)存活率和增殖能力(li)均無差異。在高或低細胞(bao)密度(du)下，冷(leng)(leng)凍(dong)介質的(de)性能在統計學上是(shi)相(xiang)同的(de)。
5- 冷凍(dong)培養基(ji)
結果表明，使用(yong)標(biao)準CPPs, CryoStor CS5和(he)由(you)PLA、10% w/v HSA和(he)5%DMSO組成的(de)(de)自制(zhi)配方，在(zai)保存Jurkat T細胞(bao)(bao)的(de)(de)活力和(he)增殖能(neng)力方面表現相似。然而(er)，CryoStor CS5似乎顯(xian)著減少(shao)了稀釋或隨(sui)機成核造成的(de)(de)應力，因(yin)此，保護細胞(bao)(bao)免受低(di)(di)溫保存CPPs(或非標(biao)準CPPs)變化的(de)(de)影(ying)響，從而(er)提高(gao)了解(jie)凍(dong)后24小時(shi)的(de)(de)存活率(lv)和(he)計數(shu)，并降低(di)(di)了結果的(de)(de)可(ke)變性(xing)。
6- 補料時(shi)間
本(ben)研究中(zhong)最顯(xian)著(zhu)的(de)(de)(de)(de)CPP是(shi)冷(leng)凍(dong)保存前培養(yang)補料的(de)(de)(de)(de)時間。盡管在低溫(wen)保存前，這是(shi)一種非(fei)常健康的(de)(de)(de)(de)培養(yang)物(wu)(存活率為93%)，但(dan)解(jie)凍(dong)前3天補充(chong)培養(yang)物(wu)似乎更容易受到低溫(wen)保存誘導的(de)(de)(de)(de)壓(ya)力，因此在低溫(wen)保存和解(jie)凍(dong)后(hou)增(zeng)殖方(fang)面都(dou)有顯(xian)著(zhu)的(de)(de)(de)(de)損(sun)失。
—— 成立于1998年美國(guo)納斯達(da)克上市公司
03- 實(shi)驗結論
-1-
解凍后(hou)立即對細胞活力和數量(liang)進行分析并不(bu)能反(fan)映冷(leng)凍保(bao)存過程(cheng)成功與(yu)否。未(wei)優化的(de)(de)冷(leng)凍培(pei)養基(ji)的(de)(de)不(bu)良影(ying)響可(ke)能要到解凍后(hou)的(de)(de)24-48小時才能檢測到，這歸(gui)因于低溫(wen)保(bao)存誘(you)導存在著延遲性(xing)細胞死亡(DOCD)這一現象。另一方面優化的(de)(de)低溫(wen)保(bao)存介質(zhi)的(de)(de)加(jia)入可(ke)以(yi)防(fang)止DOCD的(de)(de)發生，減(jian)少了變異性(xing)從而可(ke)以(yi)更準確(que)地估計(ji)了解凍后(hou)的(de)(de)活力和增殖功能。
-2-
低溫保(bao)存前的(de)(de)補料時(shi)間和培養基的(de)(de)變化對(dui)冷凍(dong)(dong)保(bao)存過程(cheng)的(de)(de)結(jie)(jie)果有(you)重(zhong)要影響，這可(ke)能(neng)(neng)是歸(gui)因于一些參數(shu)，包括在冷凍(dong)(dong)前活力試驗中沒有(you)體現出來(lai)的(de)(de)壓力積累，但與DOCS結(jie)(jie)合從而導致解凍(dong)(dong)后活力和功能(neng)(neng)的(de)(de)顯著(zhu)損失(shi)。
-3-
冰(bing)成(cheng)核的隨機(ji)性本質上導(dao)致了細胞(bao)在低溫(wen)保(bao)存過(guo)程中(zhong)所承(cheng)受的低溫(wen)保(bao)存誘導(dao)應力(li)的變(bian)化。因此適當(dang)的成(cheng)核對模型T細胞(bao)的生存能力(li)和增(zeng)殖(zhi)能力(li)有顯(xian)著(zhu)影響。
-4-
在37°C介質中(zhong)稀(xi)釋(shi)(類似于患者給藥(yao)情景)是解凍后的推薦稀(xi)釋(shi)方法，因此強烈(lie)建議如此操作并且出于分析(xi)目的，細(xi)胞也應在溫暖介質中(zhong)稀(xi)釋(shi)以盡量減少在洗(xi)滌過程(cheng)中(zhong)滲(shen)透性細(xi)胞腫脹和溶(rong)解。
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