發布時間：2022/08/08 點擊數：490 德國(guo)Nordmark品牌的(de)(de)NB膠(jiao)原(yuan)酶(mei)系列產品提供科研級到GMP級的(de)(de)全(quan)線組織細胞(bao)解離方法（下圖），同(tong)時(shi)針對天然膠(jiao)原(yuan)酶(mei)混合物（包括(kuo)膠(jiao)原(yuan)酶(mei)I類和II類，中(zhong)性蛋白酶(mei)和梭狀(zhuang)(zhuang)芽(ya)胞(bao)桿(gan)菌(jun)），從綿羊體內提取的(de)(de)抗(kang)膠(jiao)原(yuan)酶(mei)多克(ke)隆抗(kang)體，可識別梭狀(zhuang)(zhuang)芽(ya)胞(bao)桿(gan)菌(jun)膠(jiao)原(yuan)酶(mei)的(de)(de)多種亞型，用于ELISA和Western blot等(deng)的(de)(de)方法定(ding)量分析(xi)細胞(bao)制劑中(zhong)殘(can)留的(de)(de)膠(jiao)原(yuan)酶(mei)。
圖：膠原(yuan)酶NB系列(lie)產品-從科研級到GMP級全線(xian)組(zu)織(zhi)細胞解離方(fang)案
本次小編(bian)將分享Nordmark建立的(de)檢(jian)(jian)測(ce)膠原(yuan)(yuan)酶的(de)基(ji)于羊多(duo)克隆抗體(ti)的(de)雙(shuang)抗夾心ELISA方(fang)法，為檢(jian)(jian)測(ce)生物制品中(zhong)的(de)殘留膠原(yuan)(yuan)酶的(de)質(zhi)量控制和(he)后續安全的(de)臨床治療打下扎實的(de)基(ji)礎。
溫馨提示：
該雙抗(kang)夾心ELISA法(fa)（包括所用(yong)的(de)抗(kang)體(ti)(ti)）適用(yong)于(yu)定量檢(jian)測(ce)NB - 4標準(zhun)級(ji)膠(jiao)原酶，NB - 5無菌級(ji)膠(jiao)原酶或NB - 6 GMP級(ji)膠(jiao)原酶產品(pin)，使用(yong)該protocol以及抗(kang)體(ti)(ti)可檢(jian)測(ce)的(de)膠(jiao)原酶濃度(du)低至(zhi)在100 ng/ml。
實驗準(zhun)備
包被緩(huan)沖(chong)液(ye): 50 mM Na2CO3, 用1 M HCl調節pH 9.6；
磷酸鹽緩沖液 (PBS)：1 X, 用0.1 M NaOH調節pH 7.4；
洗滌緩沖(chong)液: PBS 含 0.05 % (v/v) Tween 20；
封閉液: PBS 含 0.1 % 牛血(xue)清白蛋白；
底物溶(rong)液：將0.2 M Na2HPO4 以及(ji) 0.1 M 檸檬酸溶于水, 加入(ru)0.04 % (w/v) 正交鄰苯二胺二鹽酸鹽，然(ran)后用0.1 M NaOH調(diao)節pH 5.0。
注意: 鄰苯二(er)胺二(er)鹽酸(suan)鹽是光敏性(xing)的!
該底(di)物溶液(ye)可在-20°C下保(bao)存6個月(yue)。
過氧化氫溶液： 30 % (w/w) （溶劑為水）
反應終止液: 2 M H2SO4 （溶劑為水(shui)）
檢測步驟
1、將(jiang)捕(bu)獲抗體(ti)(ti)用(yong)包被緩沖液中稀釋至(zhi)10 μg/ml，每(mei)孔中加入50 μl (含500 ng 捕(bu)獲抗體(ti)(ti)) 。
2、用蓋子蓋上微孔板(ban)，然后(hou)在+2 to +8 °C孵(fu)育至(zhi)少16 h。
3、將板(ban)子倒過來懸空，在(zai)紙巾(jin)(jin)上輕輕敲(qiao)出殘(can)留(liu)的(de)液(ye)(ye)體。每孔加入300 μl洗滌緩沖液(ye)(ye)，室溫(wen)孵育30 s進(jin)行(xing)洗滌，總(zong)共洗三(san)次。最后一步洗完(wan)后，在(zai)紙巾(jin)(jin)上輕輕敲(qiao)出殘(can)留(liu)的(de)液(ye)(ye)體。
4、每孔加300 μl 封閉液。
5、用蓋子蓋上微孔板，然后在37 ℃孵育(yu)至(zhi)少30 min。
6、洗板三次（方法同步(bu)驟(zou)3）。
7、為(wei)了制(zhi)備標準(zhun)曲線，將(jiang)膠原酶(mei)標準(zhun)品(pin)(三份(fen))用新鮮緩沖液(ye)（跟即將(jiang)沖洗細胞的緩沖液(ye)相同）在(zai)冰上稀(xi)(xi)釋(shi)至1 ng/ml ~ 10 μg/ml，如果(guo)沒有該(gai)緩沖液(ye)，則使用洗滌緩沖液(ye)（含(han)0.05% (v/v)吐溫20的PBS）稀(xi)(xi)釋(shi)標準(zhun)品(pin)。將(jiang)不含(han)膠原酶(mei)的緩沖液(ye)作為(wei)空白，用稀(xi)(xi)釋(shi)標準(zhun)品(pin)的緩沖液(ye)在(zai)冰上稀(xi)(xi)釋(shi)檢測樣(yang)本。
8、每孔加入上述溶(rong)液100 μl。
9、將板子(zi)蓋上蓋密封(feng)在37℃恒溫(wen)搖床下以(yi)300 rpm 孵(fu)育60mins。
10、洗板(ban)三次（方法同(tong)步驟(zou)3）。
11、將檢測抗體(ti)在(zai)洗滌緩沖(chong)液(ye)中稀釋(shi)至(zhi)5 μg/ml的最終(zhong)溶液(ye)。每(mei)孔(kong)加50 μl (含250ng檢測抗體(ti))。
12、將板子蓋(gai)上(shang)蓋(gai)密封在37℃恒溫搖床下以300 rpm 孵(fu)育(yu)60mins。
13、洗板三次（方法(fa)同步驟3）。
14、每1ml底物(wu)溶液加入1 μl H2O2 , 混合后每孔加入100 μl 。
15、將板子蓋好封閉(bi)，室溫黑暗中孵育(yu)20-30分(fen)鐘。
16、每孔加50 μl反應(ying)終止液停止反應(ying)。
17、加入反(fan)應終止液后30分(fen)鐘內用酶標儀(yi)在492 nm處(chu)測量光密(mi)度，繪制標準曲線，定量洗滌細胞的(de)緩沖液中(zhong)的(de)殘留膠原酶。
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