發布時間：2022/08/01 點擊數：1184 一、簡介
脂(zhi)肪(fang)組(zu)(zu)(zu)織(zhi)一(yi)直(zhi)被認(ren)為(wei)是多(duo)種(zhong)分化(hua)潛能(neng)的(de)(de)多(duo)功(gong)能(neng)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)類(lei)型(xing)包括干細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)豐富來源(yuan)，一(yi)般可(ke)(ke)通(tong)過抽脂(zhi)的(de)(de)方法(fa)收集。基(ji)質血管成(cheng)分細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(SVF) 從脂(zhi)肪(fang)組(zu)(zu)(zu)織(zhi)提取出(chu)來的(de)(de)異質性混合細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)群(qun)體，含(han)有(you)可(ke)(ke)塑性較(jiao)高的(de)(de)脂(zhi)肪(fang)組(zu)(zu)(zu)織(zhi)來源(yuan)的(de)(de)間(jian)充(chong)質干細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，SVF從脂(zhi)肪(fang)組(zu)(zu)(zu)織(zhi)中(zhong)分離后(hou)可(ke)(ke)用(yong)(yong)于直(zhi)接應用(yong)(yong)或(huo)在進一(yi)步的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)分化(hua)以產生特(te)定的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)類(lei)型(xing)（文獻1）。今天小編(bian)主要給大家分享的(de)(de)是利用(yong)(yong)Nordmark 無動物源(yuan)GMP級膠(jiao)原酶和中(zhong)性蛋白酶組(zu)(zu)(zu)合從脂(zhi)肪(fang)組(zu)(zu)(zu)織(zhi)中(zhong)分離提取SVF的(de)(de)實驗相關流程Protocol。
（圖）無動(dong)物(wu)源膠原(yuan)酶(mei)(mei)AF-1 GMP級(ji)和(he)中性蛋白酶(mei)(mei)AF GMP級(ji)膠原(yuan)酶(mei)(mei)組合
二、實驗準(zhun)備
酶溶液制備
將0.4 PZU/ml無動物源GMP級膠原(yuan)酶(mei)(mei)AF-1和(he)0.2 DMC U/ml中性蛋白(bai)酶(mei)(mei)用乳酸鹽林格（LR）溶(rong)(rong)液(ye)(ye)溶(rong)(rong)解制備酶(mei)(mei)工作溶(rong)(rong)液(ye)(ye)，請確(que)(que)保酶(mei)(mei)溶(rong)(rong)液(ye)(ye)液(ye)(ye)完全溶(rong)(rong)解且配好(hao)后一直置(zhi)于冰上直至使用。如果(guo)您計劃使用別的緩沖液(ye)(ye)，請確(que)(que)保該緩沖液(ye)(ye)中Ca2?的濃(nong)度(du)不低于2mM更(geng)有助于膠原(yuan)酶(mei)(mei)的活性發揮。
脂肪提取和(he)洗滌
取用200ml原抽(chou)脂(zhi)液(大概會析(xi)出(chu)50-100ml脂(zhi)肪組織)，建議在吸脂(zhi)液在新(xin)鮮的狀態立即(ji)進行實驗。
1、將抽脂液加熱至(zhi)37 – 38℃
2、將預(yu)熱(re)過的抽(chou)脂液(ye)用LR溶液(ye)通過搖晃和傾析法清洗3次(ci)直到脂肪相呈黃色(se)，液(ye)體相呈透明(淡粉色(se))。每(mei)次(ci)洗滌后(hou)將底(di)部的水相完全去除(chu)，然(ran)后(hou)再處理上(shang)層相的脂肪組織(zhi)。
3、第三(san)次洗滌后靜置至少5分鐘。除了傾析法也(ye)可以通過在室溫下(xia)200g離心5分鐘實現脂肪(fang)的提取(qu)分離。
一般離心后會有三層：
第一層(ceng)：脂肪組織
第二層：膨脹的一些廢(fei)棄物
第三層(ceng)：紅細胞(bao)和細胞(bao)外基質(ECM)材料(liao)
4、使用(yong)60ml導管(guan)尖端注射器抽吸洗凈(jing)和析出的上(shang)層脂肪(fang)組織，并將其(qi)轉移(yi)到適當的管(guan)或容器中。
SVF提(ti)取
獲得(de)脂肪組織后可以直接(jie)進(jin)行脂肪組織消化(hua)步驟，主要(yao)步驟如(ru)下：
1、在脂(zhi)肪組(zu)織樣品中加入相同(tong)體積(ji)的(de)酶溶液(脂(zhi)肪組(zu)織與酶溶液比(bi)例1:1)，即10g脂(zhi)肪組(zu)織處(chu)理加入10 ml含酶的(de)LR溶液(GMP級(ji)別(bie)的(de)0.4 PZ U/ml膠(jiao)原酶AF-1和0.2 PZ U/ml中性蛋(dan)白(bai)酶AF級(ji))。最終解離溶液中AF-1 GMP級(ji)終濃度大致為0.2 PZ U/ml，中性蛋(dan)白(bai)酶的(de)終濃度大致為0.1 DMC U/ml。
2、解離工作溶液放置在搖床中37℃恒溫以150轉/分(fen)搖50分(fen)鐘
3、離心和SVF顆粒重懸
4、600克離心(xin)10分鐘會拿到三(san)層溶液，分別為:
第一(yi)層：分解的(de)組織(zhi)碎片
第二層：廢(fei)棄(qi)物
第(di)三層(ceng)：SVF顆粒(li)和ECM材(cai)料
取上清(qing)，加入1ml LR溶液通過(guo)冷卻或稀(xi)釋辦法停止酶(mei)解離(li)工(gong)作，在這過(guo)程中請確保細(xi)胞良好的懸(xuan)浮狀態。
5、抽吸整個SVF懸(xuan)浮細(xi)胞，通過400微米的細(xi)胞過濾(lv)器過濾(lv)將SVF細(xi)胞與(yu)ECM材(cai)料分離(li)，并收集(ji)到(dao)一(yi)個新的容器中。
6、徹底搖勻樣(yang)品并根(gen)據需要進(jin)行細(xi)胞計數
三、SVF和ASC提取的應用文獻(xian)清單
Nordmark膠原酶NB系列(lie)產品提供(gong)(gong)從科(ke)研到GMP級的全線組(zu)織細(xi)胞(bao)解離(li)(li)方案，同時為方便用(yong)(yong)(yong)戶使用(yong)(yong)(yong)提供(gong)(gong)優化過(guo)的細(xi)胞(bao)解離(li)(li)Protocol和各類應用(yong)(yong)(yong)的大(da)量文獻(xian)支持。以下是小編選擇部分關(guan)于(yu)SVF以及(ji)脂(zhi)肪干細(xi)胞(bao)（ASC）的相關(guan)文獻(xian)清單分享：
更多應用(yong)文獻以及(ji)protocol請聯系(xi)上海曼(man)博生物。
文獻參考(kao)：
1. Oedayrajsingh-Varma MJ, van Ham SM, Knippenberg M, et al.Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure[J].Cytotherapy,2006,8:166-177.
