發布時間：2022/06/10 點擊數：424 1 前言
隨著(zhu)美國(guo)食品(pin)與藥品(pin)監(jian)督管理(li)局 (FDA) 批準轉(zhuan)基因豬的(de)(de)胰(yi)島(dao)(dao)可用(yong)于人(ren)體移(yi)植(zhi)(zhi)，異種胰(yi)島(dao)(dao)移(yi)植(zhi)(zhi)已成為(wei)具備顯(xian)著(zhu)價值和發展(zhan)潛力的(de)(de)糖尿(niao)(niao)病(bing)治(zhi)療手段(duan), 有望成為(wei)替代胰(yi)島(dao)(dao)素(su)的(de)(de)治(zhi)療Ⅰ型(xing)糖尿(niao)(niao)病(bing)的(de)(de)方(fang)法，徹(che)底改變(bian)糖尿(niao)(niao)病(bing)的(de)(de)治(zhi)療現狀(zhuang)。在使用(yong)異種或(huo)者同類種屬胰(yi)島(dao)(dao)的(de)(de)人(ren)類臨床胰(yi)島(dao)(dao)移(yi)植(zhi)(zhi)試驗中，用(yong)于胰(yi)腺分離目的(de)(de)特(te)定 GMP 級膠原(yuan)蛋白水解酶(mei)毫無疑問是成功的(de)(de)關鍵因素(su)之一。隨著(zhu)異種移(yi)植(zhi)(zhi)臨床研究的(de)(de)不斷深(shen)入(ru)，分離試劑(ji)和消化(hua)酶(mei)在異種移(yi)植(zhi)(zhi)中的(de)(de)作用(yong)日益突出。
2 實驗方法
本篇(pian)中(zhong)實驗(yan)人員(yuan)評估了兩種(zhong) GMP 膠(jiao)原酶(mei)(mei)(mei)：德國 Nordmark 的 GMP 級膠(jiao)原酶(mei)(mei)(mei) AF-1 GMP 以及 Roche 的 Liberase MTF C / T GMP 級和標(biao)準(zhun)非 GMP 膠(jiao)原酶(mei)(mei)(mei) P(Roche) 在(zai)豬胰島異種(zhong)移植過程中(zhong)用于胰島組(zu)織解離(li)的胰島質量控制方面的比較。
主要是采用標(biao)準快速采集(ji)法從 16 ～ 17 月齡(ling)尤卡坦小(xiao)型豬中分(fen)離(li)出成年豬胰(yi)島(dao)(dao)(dao)。從平均體(ti)重(zhong)為 50 kg 左右(you)的(de)豬中提(ti)取出的(de) 40 g 左右(you)的(de)胰(yi)腺組織(zhi)，利用各組膠原(yuan)酶進(jin)行胰(yi)島(dao)(dao)(dao)組織(zhi)解離(li)，在胰(yi)島(dao)(dao)(dao)分(fen)離(li)培(pei)養(yang)后(hou)第 1 天進(jin)行一系列的(de)胰(yi)島(dao)(dao)(dao)質(zhi)量控制評價，包括胰(yi)島(dao)(dao)(dao)產量、胰(yi)島(dao)(dao)(dao)尺寸 (IEQ)、胰(yi)島(dao)(dao)(dao)活力 (吖啶(ding)橙/碘(dian)化丙啶(ding)) 和(he)體(ti)外功(gong)能(neng)活力 (GSIS) 參(can)數。
表1 組織消化和胰島(dao)分離過程
3 三種膠原酶在胰島移(yi)植的對(dui)比(bi)實驗結果
3-1 圖1胰島產量比較各膠原酶組胰島產率對比
為了比較不同消化酶(mei)組間胰島(dao)(dao)產(chan)(chan)量(liang)的(de)(de)(de)差異, 用(yong)三組膠原酶(mei)分離(li)豬(zhu)胰島(dao)(dao)，并(bing)測量(liang)每克胰腺(xian)組織的(de)(de)(de)胰島(dao)(dao)產(chan)(chan)量(liang)，在 37℃ 的(de)(de)(de)組織培(pei)養第(di)(di) 1 天(tian)計算胰島(dao)(dao)當量(liang) (IE)。培(pei)養第(di)(di) 1 天(tian)后，用(yong)膠原酶(mei) P 分離(li)的(de)(de)(de)豬(zhu)胰島(dao)(dao)平(ping)均(jun)產(chan)(chan)生(sheng) 8302±986IEQ/g ，共產(chan)(chan)生(sheng) 337 400±42 341 IEQS。用(yong) AF-1 GMP 級(ji)膠原酶(mei)分離(li)的(de)(de)(de)豬(zhu)胰島(dao)(dao)，平(ping)均(jun)產(chan)(chan)率(lv)為 16 586±1391 IEQ/g，共產(chan)(chan)生(sheng) 723 013 +48 871 IEQS 。在 Liberase MTF C/T GMP 級(ji)組中(zhong)，平(ping)均(jun)產(chan)(chan)率(lv)為 16 517±1127 IEQ/g ，總 IEQ 為 683 369±82 839(圖 1)。總的(de)(de)(de)來說三組相比：Liberase MTF C/T GMP 級(ji)胰島(dao)(dao)分離(li)物的(de)(de)(de)產(chan)(chan)率(lv)顯(xian)著高于膠原酶(mei) P，但 GMP 級(ji)膠原酶(mei) AF-1 組與 Liberase MTF C/T GMP 級(ji)組相比無(wu)顯(xian)著差異。
圖(tu)1 胰島產(chan)量比較
3-2 各膠原酶組胰島分離尺寸大小對(dui)比
組(zu)織培(pei)養 1 天(tian)后，DTZ 染色監測(ce)胰(yi)(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)(dao)形態。通過比(bi)較(jiao)(jiao)胰(yi)(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)(dao)大小(xiao)分(fen)(fen)(fen)布(bu)(bu)(bu)，膠(jiao)(jiao)原(yuan)酶(mei)(mei)(mei)(mei) P 與其他兩種 GMP 酶(mei)(mei)(mei)(mei)相比(bi)，小(xiao)胰(yi)(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)(dao)組(zu)織尺(chi)寸(cun)在(zai)(zai) 50-100um 區(qu)間分(fen)(fen)(fen)布(bu)(bu)(bu)的量明顯(xian)(xian)較(jiao)(jiao)多(duo)。幾組(zu)的區(qu)間分(fen)(fen)(fen)布(bu)(bu)(bu)比(bi)例(li)(li)分(fen)(fen)(fen)別是(shi)：膠(jiao)(jiao)原(yuan)酶(mei)(mei)(mei)(mei) P: 62 ±2.5%，Liberase MTF C/T GMP 級(ji):45.0±3.38%，Nordmark 膠(jiao)(jiao)原(yuan)酶(mei)(mei)(mei)(mei) AF-1 GMP 級(ji)組(zu):38.3±5.9%。胰(yi)(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)(dao)組(zu)織尺(chi)寸(cun)在(zai)(zai) 100-150um 區(qu)間統計顯(xian)(xian)示：膠(jiao)(jiao)原(yuan)酶(mei)(mei)(mei)(mei) AF-1 GMP 級(ji)組(zu)分(fen)(fen)(fen)布(bu)(bu)(bu)比(bi)例(li)(li) (膠(jiao)(jiao)原(yuan)酶(mei)(mei)(mei)(mei) AF-1 GMP 等級(ji):51.7 + 5.2%) 顯(xian)(xian)著高于膠(jiao)(jiao)原(yuan)酶(mei)(mei)(mei)(mei) P（30.5±1.8%）和(he) Liberase MTF C/T GMP 級(ji)別:44.7±2.0%。總的來說，兩組(zu) GMP 級(ji)膠(jiao)(jiao)原(yuan)酶(mei)(mei)(mei)(mei)與非 GMP 粗酶(mei)(mei)(mei)(mei)分(fen)(fen)(fen)離得到的胰(yi)(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)(dao)大小(xiao)尺(chi)寸(cun)比(bi)較(jiao)(jiao)中(zhong)。GMP 級(ji)組(zu)中(zhong)，Nordmark 酶(mei)(mei)(mei)(mei)比(bi) Liberase MTF C/T GMP 級(ji)的分(fen)(fen)(fen)離獲得胰(yi)(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)(dao)更大。胰(yi)(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)(dao)大小(xiao)區(qu)間分(fen)(fen)(fen)布(bu)(bu)(bu)比(bi)例(li)(li)，尤其是(shi)小(xiao)尺(chi)寸(cun)胰(yi)(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)(dao)組(zu)織（膠(jiao)(jiao)原(yuan)酶(mei)(mei)(mei)(mei)分(fen)(fen)(fen)離獲得的胰(yi)(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)(dao)越小(xiao)，說明分(fen)(fen)(fen)離過程(cheng)中(zhong)胰(yi)(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)(dao)的損壞(huai)和(he)破碎越高）區(qu)間比(bi)例(li)(li)結果為：在(zai)(zai) 50 ～ 100 um 胰(yi)(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)(dao)尺(chi)寸(cun)大小(xiao)分(fen)(fen)(fen)布(bu)(bu)(bu)中(zhong)，Nordmark 膠(jiao)(jiao)原(yuan)酶(mei)(mei)(mei)(mei) AF-1 GMP 級(ji)組(zu)較(jiao)(jiao)膠(jiao)(jiao)原(yuan)酶(mei)(mei)(mei)(mei) P 和(he) Liberase MTF C/T GMP 級(ji)胰(yi)(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)(dao)的分(fen)(fen)(fen)布(bu)(bu)(bu)低。
圖2 DTZ 染(ran)色胰島形態監測 (X40) 及胰島細胞大小(xiao)分(fen)析
3-3 各膠(jiao)原酶(mei)組(zu)胰島分離活力(li)對(dui)比
采(cai)用吖(a)啶橙 (AO) 和碘(dian)化丙啶 (Pl) 染色，在培養第 1 天按(an)照既定(ding)方案重(zhong)復測定(ding)胰(yi)(yi)島活力(li)。膠原酶 P(82.7 + 1.3%) 組(zu)胰(yi)(yi)島活力(li)相(xiang)對較(jiao)低(di)，但研(yan)究者發現兩組(zu) GMP 級(ji)膠原酶的分離(li)得到的胰(yi)(yi)島活力(li)之間沒有(you)顯著差異 (表 2)。
表2 GMP 級酶和(he)粗酶組的胰島產量總結
3-4 各膠原酶組胰(yi)島分離功能對比(bi)
采(cai)用葡萄糖刺(ci)(ci)激胰(yi)島(dao)素(su)分泌法 (GSIS) 驗證胰(yi)島(dao)在低(di)濃(nong)度 (60 mg/dL) 和高(gao)濃(nong)度 (300 mg/dL) 葡萄糖刺(ci)(ci)激下的(de)體(ti)外(wai)動態功(gong)能(neng)反(fan)應。測定豬胰(yi)島(dao)素(su)水(shui)平，采(cai)用 ELISA 法分析(xi)，并以刺(ci)(ci)激指(zhi)數 (Sl) 值表(biao)示。37℃ 培養第 1 天(tian)后，Nordmark GMP 膠(jiao)原酶組分離的(de)胰(yi)島(dao)的(de) Sl 為 (4.73 + 0.23) ，Liberase MTF C/ GMP 級(ji)分離的(de)胰(yi)島(dao) (3.87±0.12)，前兩(liang)組均(jun)顯著(zhu)(zhu)高(gao)于膠(jiao)原酶 P 分離的(de) SI 值 (2.07±0.02)。與粗膠(jiao)原酶 P 相比，其(qi)他兩(liang)種 GMP 級(ji)組的(de)刺(ci)(ci)激指(zhi)數 SI- 胰(yi)島(dao)功(gong)能(neng)水(shui)平均(jun)顯著(zhu)(zhu)升高(gao)。備注：SI 刺(ci)(ci)激指(zhi)數表(biao)現為高(gao)血糖時胰(yi)島(dao)素(su)分泌比低(di)血糖時高(gao)。
3-5 各(ge)膠原酶(mei)組內毒(du)素(su)水(shui)平檢測比較(jiao)
內(nei)毒素(su)濃度測(ce)定(ding)(ding)采用(yong) Pierce LAL 顯色內(nei)毒素(su)定(ding)(ding)量試劑盒，分(fen)離的(de)胰島在冰(bing)中被聲(sheng)波(bo)探(tan)測(ce)了30秒(miao)。溶解后的(de)細(xi)胞在冰(bing)上孵育 10 分(fen)鐘檢(jian)測(ce)內(nei)毒素(su)水平。與膠原酶P相比，兩(liang)組 GMP 級膠原酶分(fen)離得(de)到的(de)胰島組織(zhi)的(de)內(nei)毒素(su)水平均顯著降低(di)，符(fu)合低(di)于 30 EU/mL 的(de)標準(zhun)。
圖(tu)3 離(li)體胰島葡(pu)萄糖刺激指數(shu)
4 結論(lun)
本實(shi)驗(yan)研究既驗(yan)證了(le)使用特定(ding)的(de)(de)組(zu)合(he) GMP 級(ji)膠原酶試(shi)劑(ji)進行成(cheng)年(nian)豬(zhu)胰(yi)(yi)(yi)島分離用于異種(zhong)移(yi)植試(shi)驗(yan)的(de)(de)重要性，同時確定(ding)了(le)如何從一(yi)個成(cheng)年(nian)豬(zhu)胰(yi)(yi)(yi)腺組(zu)織中分離獲得(de)足夠(gou)數量(liang)(liang)的(de)(de)胰(yi)(yi)(yi)島為臨床胰(yi)(yi)(yi)島移(yi)植提(ti)供重組(zu)準備的(de)(de)能力(li)。最終(zhong)證明 GMP 級(ji)膠原酶是一(yi)種(zhong)高效(xiao)的(de)(de)增加胰(yi)(yi)(yi)島產量(liang)(liang)、大(da)小，活力(li)和(he)功能的(de)(de)酶，并(bing)且(qie)可保(bao)持獲得(de)的(de)(de)胰(yi)(yi)(yi)島組(zu)織在較低和(he)可接受(shou)的(de)(de)內毒素水平。因此可認為這種(zhong)可靠的(de)(de)、可重復使用的(de)(de) GMP 級(ji)酶分離豬(zhu)胰(yi)(yi)(yi)島的(de)(de)方法，將為異種(zhong)胰(yi)(yi)(yi)島移(yi)植治療Ⅰ型糖尿病提(ti)供極大(da)的(de)(de)幫(bang)助。
