發布時間：2022/07/06 點擊數：897 你們還整天呆在實(shi)驗室苦(ku)(ku)逼的做Western Blot嗎？有(you)沒(mei)有(you)因為封閉不完全導致條帶背景不能滿足實(shi)驗要(yao)求而捶(chui)胸痛哭，或者(zhe)苦(ku)(ku)于封閉時間過久而耽誤(wu)自己(ji)“美(mei)好”的科研(yan)人生。今天就(jiu)讓我(wo)們來談(tan)一(yi)談(tan)WB中封閉過程，在此之前，先讓我(wo)們回(hui)顧一(yi)下Western Blot過程：
蛋白(bai)(bai)免疫(yi)印(yin)跡（Western Blot）是根(gen)據抗原(yuan)抗體(ti)的(de)特(te)異性(xing)(xing)結合檢測(ce)復雜樣品(pin)中的(de)某種(zhong)蛋白(bai)(bai)的(de)方(fang)法。WB可用于鑒(jian)定(ding)(ding)(ding)某種(zhong)蛋白(bai)(bai)，并(bing)能對蛋白(bai)(bai)進行定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)和(he)(he)半定(ding)(ding)(ding)量分析(xi)，該法是在凝膠電泳和(he)(he)固相免疫(yi)測(ce)定(ding)(ding)(ding)技術(shu)基(ji)礎上發展起來的(de)一(yi)種(zhong)新的(de)免疫(yi)生化技術(shu)，具有SDS-PAGE的(de)高分辨力和(he)(he)固相免疫(yi)測(ce)定(ding)(ding)(ding)的(de)高特(te)異性(xing)(xing)和(he)(he)敏感性(xing)(xing)，現(xian)已成(cheng)為蛋白(bai)(bai)分析(xi)的(de)一(yi)種(zhong)常規技術(shu)。
一、WB的封閉(bi)過程
當我們(men)(men)辛辛苦苦做完的(de)(de)免疫(yi)印跡實驗，結果卻出現背景過高，信號(hao)又太弱的(de)(de)現象，這就(jiu)很有可能是(shi)你的(de)(de)封閉過程(cheng)(cheng)沒有處理(li)好的(de)(de)原因。在(zai)這里(li)就(jiu)讓我們(men)(men)先(xian)來了(le)解一下(xia)封閉過程(cheng)(cheng)，我們(men)(men)在(zai)做western blot實驗時，會用到固(gu)相載體（如(ru)NC膜(mo)，PVDF膜(mo)），在(zai)這些(xie)固(gu)相載體表面(mian)有很多(duo)孔(kong)(kong)洞，通過上游的(de)(de)電轉(zhuan)過程(cheng)(cheng)，凝(ning)膠(jiao)上的(de)(de)蛋(dan)(dan)白被轉(zhuan)移到固(gu)相載體上，蛋(dan)(dan)白以機械填補(bu)（堆積）和吸附的(de)(de)方(fang)式結合于表面(mian)。也就(jiu)是(shi)說蛋(dan)(dan)白被塞進了(le)表面(mian)的(de)(de)孔(kong)(kong)洞里(li)面(mian)，但由于蛋(dan)(dan)白并不是(shi)連續的(de)(de)，它們(men)(men)會存在(zai)許多(duo)空隙(xi)，并且我們(men)(men)用的(de)(de)抗(kang)體本(ben)質也是(shi)蛋(dan)(dan)白，也會被吸附在(zai)孔(kong)(kong)洞之中，這樣(yang)就(jiu)會有許多(duo)非(fei)特異性吸附，從(cong)而干擾正常結果的(de)(de)呈現。
而常見(jian)的(de)(de)(de)(de)封閉過(guo)程就(jiu)是利用(yong)封閉液(ye)(ye)中的(de)(de)(de)(de)蛋白讓其與(yu)固(gu)(gu)相載體(ti)表(biao)(biao)面的(de)(de)(de)(de)空白位置(zhi)結(jie)(jie)合(he)(he)，同樣(yang)(yang)以機(ji)械填補（堆積(ji)）和吸附覆(fu)蓋(gai)的(de)(de)(de)(de)方式(shi)結(jie)(jie)合(he)(he)在膜上，從而將(jiang)(jiang)結(jie)(jie)合(he)(he)位點填補和覆(fu)蓋(gai)，避免后(hou)期一(yi)抗(kang)的(de)(de)(de)(de)非特(te)(te)異性(xing)結(jie)(jie)合(he)(he)，我們(men)將(jiang)(jiang)這(zhe)個過(guo)程稱之(zhi)為(wei) “封閉”。同樣(yang)(yang)，這(zhe)兩種作用(yong)使(shi)封閉液(ye)(ye)中的(de)(de)(de)(de)蛋白能夠牢固(gu)(gu)的(de)(de)(de)(de)結(jie)(jie)合(he)(he)在空白位置(zhi)上，這(zhe)樣(yang)(yang)抗(kang)體(ti)蛋白就(jiu)不會被非特(te)(te)異性(xing)的(de)(de)(de)(de)吸附到膜上，而只(zhi)會跟特(te)(te)異性(xing)蛋白結(jie)(jie)合(he)(he)。從而使(shi)結(jie)(jie)果呈現(xian)的(de)(de)(de)(de)更(geng)具有說服(fu)力，表(biao)(biao)達(da)意義(yi)也更(geng)明顯。
總的來說，封閉過程是為了避免高背景和非特異性條帶的發生，這么一說，大家對封閉過程有了一個大致的了解了吧，是不是覺得很簡單，雖然簡單但并不意味著封閉就不重要，恰恰相反，他是整個WB承上啟下的一環，也是你整個實驗成功的關鍵。
二、常用的封(feng)閉液
從上述我們可以(yi)看出，封(feng)閉過程是(shi)Western Blot 至關重(zhong)要的(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)部分， 所(suo)以(yi)正確的(de)(de)(de)(de)(de)封(feng)閉液選擇可以(yi)讓抗(kang)體更(geng)好(hao)更(geng)準(zhun)確的(de)(de)(de)(de)(de)和抗(kang)原結合，為(wei)成功的(de)(de)(de)(de)(de)WB奠(dian)定基礎。雖然這個步驟操作簡(jian)單，但是(shi)封(feng)閉液的(de)(de)(de)(de)(de)選擇卻是(shi)令(ling)很多(duo)科研人(ren)頭疼(teng)的(de)(de)(de)(de)(de)問題。接下來(lai)我帶大家了解一(yi)下用(yong)(yong)于WB實(shi)驗常用(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)些封(feng)閉液。
1、脫脂奶粉
脫(tuo)脂(zhi)(zhi)奶粉(fen)屬于(yu)(yu)最經濟的封閉(bi)(bi)緩(huan)沖液了，需要(yao)時甚至可以直接(jie)從超市購買(mai)，通常(chang)使(shi)用濃度為(wei) 2.5-5% （w/v）。但由(you)于(yu)(yu)脫(tuo)脂(zhi)(zhi)奶粉(fen)是許多種蛋(dan)白(bai)質的混(hun)合物，里面可能存在生(sheng)物素和堿性(xing)磷(lin)(lin)酸酶，一定程(cheng)度上可能會導(dao)致背(bei)景污染，因此(ci)不適合生(sheng)物素—親和素的檢測方法。此(ci)外，其中含有(you)一定量的酪蛋(dan)白(bai)（casein），是一種磷(lin)(lin)蛋(dan)白(bai)（phosphoprotein），如果你的目標蛋(dan)白(bai)是磷(lin)(lin)蛋(dan)白(bai)的話(hua)，封閉(bi)(bi)過程(cheng)不要(yao)選擇(ze)脫(tuo)脂(zhi)(zhi)奶粉(fen)作為(wei)封閉(bi)(bi)液，否則會有(you)很(hen)多背(bei)景信號（background signal）。即(ji)使(shi)你的目標蛋(dan)白(bai)不是磷(lin)(lin)蛋(dan)白(bai)，因為(wei)是蛋(dan)白(bai)質的混(hun)合物，所以也容易產生(sheng)較高的背(bei)景信號。
2、牛血清(qing)白(bai)(bai)蛋白(bai)(bai)（BSA）
牛(niu)(niu)血(xue)清(qing)(qing)白(bai)(bai)(bai)蛋白(bai)(bai)(bai)（Bovine Serum Albumin，簡稱BSA）是從(cong)牛(niu)(niu)血(xue)清(qing)(qing)中提(ti)純(chun)之后的(de)(de)一種球蛋白(bai)(bai)(bai)，也是實驗室除了脫脂奶粉之外最常用的(de)(de)封閉緩(huan)沖液。BSA不是磷蛋白(bai)(bai)(bai)而且(qie)是單一蛋白(bai)(bai)(bai)，不會出(chu)現(xian)封閉磷酸化蛋白(bai)(bai)(bai)時出(chu)現(xian)背景過(guo)高(gao)的(de)(de)現(xian)象，但是提(ti)純(chun)過(guo)程中有(you)可(ke)(ke)能(neng)含(han)有(you)IgG或其他血(xue)清(qing)(qing)蛋白(bai)(bai)(bai)等污染物，這(zhe)些(xie)蛋白(bai)(bai)(bai)都可(ke)(ke)以和哺乳動物抗體產生(sheng)交叉反應，從(cong)而增加非特異(yi)性背景信號 (non-specific background noise）。
3、血清
血(xue)(xue)(xue)清是許多蛋白質的混合(he)物，同樣(yang)(yang)可(ke)以(yi)被用(yong)來當做(zuo)封閉劑。首先，血(xue)(xue)(xue)清能像BSA一(yi)樣(yang)(yang)封閉一(yi)些(xie)非(fei)特(te)異性的蛋白結合(he)。此外，待檢樣(yang)(yang)本中(zhong)可(ke)能會有Fc受體，可(ke)以(yi)和(he)(he)抗(kang)體恒定(ding)區（Fc）結合(he)，與抗(kang)體特(te)異性無(wu)關，因(yin)為封閉血(xue)(xue)(xue)清中(zhong)有抗(kang)體，因(yin)此可(ke)以(yi)封閉掉實驗用(yong)一(yi)抗(kang)及二(er)抗(kang)和(he)(he)樣(yang)(yang)本中(zhong)Fc受體之間結合(he)，進一(yi)步(bu)降低(di)非(fei)特(te)異性結合(he)。通常使用(yong)的濃度為 5-10%（w/v）。但像BSA一(yi)樣(yang)(yang)，它(ta)含有免疫(yi)球蛋白和(he)(he)血(xue)(xue)(xue)清蛋白，會和(he)(he)哺乳動物抗(kang)體產生交叉反應。
三、Q-BLOCK 一(yi)分鐘無蛋(dan)白封閉緩沖液
通過(guo)對不(bu)同種(zhong)類封(feng)(feng)(feng)閉(bi)液(ye)的(de)(de)(de)一(yi)(yi)個學習(xi)，你(ni)是(shi)(shi)不(bu)是(shi)(shi)對封(feng)(feng)(feng)閉(bi)過(guo)程有了(le)一(yi)(yi)個新的(de)(de)(de)理解。但又(you)開始(shi)迷茫自己今后的(de)(de)(de)實驗(yan)該選擇什么樣的(de)(de)(de)封(feng)(feng)(feng)閉(bi)液(ye)？確實，如果(guo)選擇了(le)不(bu)適(shi)用的(de)(de)(de)封(feng)(feng)(feng)閉(bi)液(ye)，可能會導致自己辛(xin)辛(xin)苦(ku)苦(ku)做(zuo)的(de)(de)(de)實驗(yan)結果(guo)變得慘不(bu)忍(ren)睹，不(bu)要擔心(xin)，在這(zhe)里給大家(jia)推薦一(yi)(yi)款全能性的(de)(de)(de)無蛋(dan)白(bai)封(feng)(feng)(feng)閉(bi)緩沖液(ye)，它(ta)能夠(gou)滿足你(ni)絕大多數封(feng)(feng)(feng)閉(bi)需求。“泉品”Q-BLOCK 一(yi)(yi)分鐘無蛋(dan)白(bai)封(feng)(feng)(feng)閉(bi)緩沖液(ye)，它(ta)是(shi)(shi)一(yi)(yi)種(zhong)高效快速的(de)(de)(de)封(feng)(feng)(feng)閉(bi)緩沖液(ye)。多用于Western Blot封(feng)(feng)(feng)閉(bi)階段，此外實驗(yan)條件允(yun)許的(de)(de)(de)情況下還可用于Wetern Blot過(guo)程中抗體（一(yi)(yi)抗、二抗）的(de)(de)(de)配置。純化(hua)學配方(fang)且不(bu)含蛋(dan)白(bai)質，能有效防(fang)止蛋(dan)白(bai)質交叉(cha)反(fan)應，短時間內能夠(gou)有效提高被檢測信號的(de)(de)(de)信噪比。
1、快速高(gao)效
傳統的WB實驗封閉過程，常采用BSA(牛血清白蛋白)、5%的脫脂奶粉、酪蛋白(Casein)等的封閉液，這些封閉液使用時為了充分封閉住固相載體上的抗原位點，一般需要室溫孵育1-2h或者4度封閉過夜，延緩了實驗進度，并且封閉時間過長會加大實驗風險，導致結果的不穩定性。Q-BLOCK一分鐘無蛋白封閉緩沖液針對這一點，將封閉時間縮短至一分鐘，極大的加快了整個WesternBlot過程，另外，本產品無需稀釋，即取即用，極大的節省了操作流程。
2、無蛋(dan)白(bai)質干擾
采用無蛋白配方，避免抗體與封閉劑的非特異結合，有效降低了背景。同時，本封閉劑無內源的磷酸化蛋白及生物素，對磷酸化特異抗體及生物素的檢測也不會產生干擾。
3、性能高
本(ben)封(feng)(feng)閉(bi)劑(ji)不(bu)與(yu)蛋(dan)白產(chan)生(sheng)非特異性結合(he)，因而(er)只封(feng)(feng)閉(bi)膜而(er)不(bu)會(hui)屏蔽樣(yang)品蛋(dan)白的抗體識別(bie)位點，大(da)大(da)提高了抗體檢測靈敏度。提供比傳統封(feng)(feng)閉(bi)緩沖液(ye)更好的特定信號和(he)更少(shao)的背景噪(zao)聲(sheng)，有效(xiao)提高信噪(zao)比。
4、節省抗體(ti)
此類封閉(bi)液可應用于WB后續實(shi)驗(yan)中抗(kang)體的配置，并且Q-BLOCK是無蛋白配方(fang)，用于抗(kang)體配置可有效延長抗(kang)體保存時間。能夠(gou)節省抗(kang)體用量，性(xing)價比(bi)更高。
四、實驗說明
1、從圖中可知，與(yu)其(qi)他(ta)品牌相比，Q-BLOCK不僅操作時間短，更有(you)效提高信噪(zao)比。
2、純(chun)化(hua)學配(pei)方、不含蛋白質，稀釋抗(kang)體可延長(chang)保存時間，抗(kang)體重復使用次數增(zeng)加，極大的提高了(le)抗(kang)體利用率：
這款封閉液是我們“泉品(pin)”現在主推的(de)一(yi)款產品(pin)，品(pin)質上肯定對得(de)起(qi)你的(de)選擇(ze)，使(shi)用過程中(zhong)若遇到相關技術問題(ti)可隨時與(yu)我們聯(lian)系，我們一(yi)定竭(jie)盡全力為你的(de)實驗(yan)保駕(jia)護航，使(shi)用過程沒有煩惱。
五、關于泉(quan)品
“泉品(pin)” 擁(yong)有(you)(you)專業(ye)化的資(zi)深團(tuan)(tuan)隊，負責產品(pin)的研發，生(sheng)產，質(zhi)(zhi)控，以(yi)及品(pin)牌推廣。“泉品(pin)”的理念是“有(you)(you)泉·有(you)(you)品(pin)”，泉本意(yi)(yi)指(zhi)水源，水是萬物(wu)之(zhi)源，寓意(yi)(yi)滋(zi)養，創(chuang)新，朝氣蓬勃，充滿(man)希望。品(pin)，本意(yi)(yi)為眾多，如《易(yi)經》里“云行(xing)雨施，品(pin)物(wu)流形”，現(xian)本意(yi)(yi)又為品(pin)質(zhi)(zhi)。“泉品(pin)”以(yi)創(chuang)新和高(gao)品(pin)質(zhi)(zhi)為核心價值理念，通過自身研發團(tuan)(tuan)隊，以(yi)及與國內(nei)外專業(ye)科研團(tuan)(tuan)隊強強聯合，不(bu)斷創(chuang)新，為生(sheng)命科學和醫藥研發行(xing)業(ye)提(ti)供高(gao)品(pin)質(zhi)(zhi)產品(pin)和服務。
為了追求給客戶帶來更好的服務和體驗，針對生物醫藥企業和科研用戶，我們將秉承“服務至上”的理念，為用戶提供“泉品”的樣品試用、技術支持、訂單執行及配送服務。泉品現有產品包括：澳洲胎牛血清、一分鐘無蛋白封閉緩沖液、自動化蛋白免疫雜交印跡儀（western Blot專用）、高性價比移液吸頭、不同規格離心管、血清移液管、實驗室移動熱轉印標簽打印機、涂布棒、細胞過濾篩、試劑槽、接種環等，其他新增產品敬請期待。
