發布時間：2022/11/25 點擊數：535 前言
CAR-T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)治療(liao)中(zhong)，體(ti)(ti)內(nei)T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)持久性(xing)和(he)優良(liang)的(de)(de)臨床結(jie)果(guo)之間有一定(ding)的(de)(de)相(xiang)關性(xing)，今(jin)天小編主(zhu)要(yao)引(yin)用(yong)的(de)(de)研(yan)究強調了采用(yong)必要(yao)CAR-T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)培(pei)(pei)養(yang)物的(de)(de)補充而不需要(yao)額(e)外(wai)的(de)(de)基因修飾(shi)對(dui)改善CAR - T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)制(zhi)造的(de)(de)重要(yao)性(xing)，探索(suo)了人血(xue)(xue)衍生制(zhi)品(pin)(pin)作為培(pei)(pei)養(yang)基補充劑培(pei)(pei)養(yang)CAR-T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)對(dui)CAR - T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)表型的(de)(de)影響，發現用(yong)hPL作為一種GMP級的(de)(de)培(pei)(pei)養(yang)補充劑替(ti)換傳統的(de)(de)FBS或(huo)ABS血(xue)(xue)清，可在(zai)T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)在(zai)TN期和(he)TCM期一定(ding)程度(du)上(shang)阻止CAR - T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)分化(hua)，為終產品(pin)(pin)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)治療(liao)制(zhi)劑產品(pin)(pin)中(zhong)獲(huo)得較低分化(hua)表型的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)同時在(zai)體(ti)(ti)內(nei)外(wai)與靶細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)長時間共培(pei)(pei)養(yang)的(de)(de)實驗情況(kuang)下展示了良(liang)好的(de)(de)抗(kang)腫瘤效應。
1-1 CAR-T細(xi)胞在(zai)hPL體(ti)外(wai)培養(yang)體(ti)系中(zhong)獲得維(wei)持低(di)分化T細(xi)胞表型(xing)
為(wei)了評估細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)體外擴增階段(duan)不同人血衍生物對CAR - T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)功(gong)能的影響(xiang)，研(yan)究者首先將在添(tian)加(jia)10%胎(tai)牛血清的培(pei)養(yang)基(ji)中培(pei)養(yang)的OKT3/CD28刺激的T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)，使用表達第二代(dai)前列腺干細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)抗原(PSCA)或CD19特(te)異性(xing)CAR（含內結(jie)構域(yu)CD28和CD3z）的逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)病毒載體轉(zhuan)導此(ci)T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)獲得分別為(wei)P28z和1928z的兩(liang)種T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)。轉(zhuan)導后3天T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)被分成三種組(zu)分別是：添(tian)加(jia)10%胎(tai)牛血清、添(tian)加(jia)10% ABS以及添(tian)加(jia)10% hPL的培(pei)養(yang)基(ji)中培(pei)養(yang)擴增1周(圖1a)（本(ben)實驗中每(mei)組(zu)都添(tian)加(jia)了相同量的IL-2）。
圖1a：實驗設計時間線
擴增結果發現這三組培養補充劑中(zhong)(zhong)(zhong)T細(xi)胞(bao)(bao)擴增總體無統計(ji)學差異。然而當檢(jian)查(cha)擴增細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)表(biao)型(xing)圖譜時，hPL中(zhong)(zhong)(zhong)培養組中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)顯(xian)示在CD8*和(he)CD4* T細(xi)胞(bao)(bao)部分中(zhong)(zhong)(zhong)代表(biao)初始T（TN）和(he)中(zhong)(zhong)(zhong)央記憶(yi)T細(xi)胞(bao)(bao)(TCM)的(de)(de)CCR7*細(xi)胞(bao)(bao)比例(li)明顯(xian)更高(圖1C和(he)D)。
圖1c和1d：P28z和1928z兩種T細胞在FBS/ABS/hPL不同的培(pei)養(yang)體系中擴(kuo)增時TN/TCM的比例
此(ci)外還探索了與(yu)記憶(CD62L, CD127, CD27和(he)(he)CD28)、激活(huo)(CD25和(he)(he)CD69)和(he)(he)抑制(PD1和(he)(he)TIM3)相關(guan)的其他細(xi)胞(bao)(bao)表(biao)(biao)面(mian)marker的表(biao)(biao)達(da)。hPL擴(kuo)增的細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)CD25、CD69、PD1和(he)(he)TIM3的表(biao)(biao)達(da)增加，而(er)ABS擴(kuo)增的細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)CD25、CD69、PD1和(he)(he)TIM3的表(biao)(biao)達(da)降低(di)(di)((圖S1d), 而(er)在ABS中(zhong)擴(kuo)增的細(xi)胞(bao)(bao)在CD8+和(he)(he)CD4+ T細(xi)胞(bao)(bao)亞群(qun)中(zhong)CD62L+表(biao)(biao)達(da)較低(di)(di)，以及非(fei)轉(zhuan)導T細(xi)胞(bao)(bao)(NT)、P28z和(he)(he)1928z中(zhong)CD4* T細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)CD27*CD28*群(qun)體數量的減少(圖S1c)。
圖(tu) S1c&d P28z和1928z兩種T細胞(bao)在FBS/ABS/hPL不(bu)同的培養(yang)體系中(zhong)相關(guan)細胞(bao)表明marker表達(da)
此外(wai)，研究者發現(xian)較(jiao)低的(de)(de)hPL濃度(du)(低至2.5%)也不(bu)(bu)會破(po)壞T細胞的(de)(de)生長(chang)或(huo)表型，不(bu)(bu)像FBS在濃度(du)低于5%會阻礙T細胞的(de)(de)擴增(圖S2)。
圖S2:不同濃度梯度的FBS/ABS/hPL的T細胞體外培養效果
研究者進(jin)一(yi)步的(de)通過RNAseq分析(第7天(tian)更換(huan)培養基(ji)(ji))p28z修(xiu)飾細(xi)胞(bao)的(de)特性，發現(xian)細(xi)胞(bao)在hPL培養組的(de)細(xi)胞(bao)群中高表(biao)達TN /TCM相(xiang)關基(ji)(ji)因如(ru)LEF1、FOXP1和KLF1以(yi)及(ji)較少的(de)效(xiao)應T細(xi)胞(bao)(TE)相(xiang)關基(ji)(ji)因編(bian)碼轉錄因子如(ru)TBX21、eoms和KLRG1以(yi)及(ji)效(xiao)應分子如(ru)粒酶、穿孔素和IFNy。
因此，根據以上(shang)表型和基因表達(da)譜相關研究結果，在(zai)hPL中擴增(zeng)的T細(xi)胞培養物有利于(yu)具有TN/ TCM特征(zheng)的細(xi)胞亞群的擴增(zeng)的趨勢(shi)。
1-2 TGFβ1在維持低(di)分化CAR - T細胞表型方(fang)面的(de)影響和(he)作用
以上兩種不同CAR模(mo)型(xing)的(de)研究(jiu)(jiu)中，由于hPL培養組的(de)T細(xi)胞始終優于ABS或FBS對應的(de)T細(xi)胞，所(suo)以研究(jiu)(jiu)者試圖確定具(ju)體(ti)影響(xiang)T細(xi)胞表型(xing)的(de)成分。
首(shou)先(xian)實驗人(ren)員對(dui)ABS和hPL進行了人(ren)類(lei)蛋白(bai)質(zhi)組學(xue)分析(xi)，發現與ABS相比hPL含有(you)(you)更高水平的轉(zhuan)化(hua)生長因子(zi)β1 (TGFβ1)。由于之(zhi)前的研究發現TGFβ1可以阻(zu)止(zhi)T細(xi)胞分化(hua)，促(cu)進活化(hua)和記憶(yi)T細(xi)胞的存(cun)活[參考文獻1-3]，因此(ci)初步判斷(duan)TGFβ1對(dui)維(wei)持低分化(hua)T細(xi)胞表型有(you)(you)一定的影響。
為(wei)了(le)探索TGFβ1對(dui)記憶T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)表(biao)型(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)特異性(xing)影(ying)響(xiang)，繼續在FBS和ABS培(pei)(pei)(pei)養物中添加重組(zu)TGFβ1 (5 ng/mL)，使其水(shui)平正常化到10% hPL培(pei)(pei)(pei)養物中相當的(de)(de)(de)(de)(de)水(shui)平。作(zuo)為(wei)額(e)外的(de)(de)(de)(de)(de)對(dui)照，使用轉基因表(biao)達顯性(xing)陰性(xing)TGFβ受體II (DNRII)的(de)(de)(de)(de)(de)T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)來(lai)中和hPL中的(de)(de)(de)(de)(de)TGFβ1。有(you)趣的(de)(de)(de)(de)(de)是(shi)(shi)通過(guo)TGFβ1的(de)(de)(de)(de)(de)補(bu)充(chong)，實(shi)驗者觀察到FBS和ABS培(pei)(pei)(pei)養中CCR7+細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)比(bi)例更高(gao)，而(er)DNRII T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)替(ti)代(dai)消除了(le)hPL對(dui)CCR7表(biao)達的(de)(de)(de)(de)(de)影(ying)響(xiang)。因此借助重組(zu)TGFβ1實(shi)驗證實(shi)發現(xian)TGFβ1對(dui)T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)有(you)免疫抑制作(zuo)用但是(shi)(shi)這種(zhong)外源(yuan)性(xing)補(bu)充(chong)的(de)(de)(de)(de)(de)TGFβ1對(dui)CAR - T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)殺傷(shang)溶解能力(li)有(you)不利影(ying)響(xiang)，而(er)hPL培(pei)(pei)(pei)養組(zu)的(de)(de)(de)(de)(de)CAR - T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)型(xing)和功能特征可(ke)(ke)能是(shi)(shi)多種(zhong)可(ke)(ke)溶性(xing)蛋白的(de)(de)(de)(de)(de)結果，TGFβ1可(ke)(ke)能是(shi)(shi)其中之一。
2 體外長(chang)期共(gong)培(pei)養實驗中，hPL培(pei)養的CAR - T細胞顯示(shi)出更(geng)高的增殖能力，導致(zhi)了(le)強(qiang)大的抗腫瘤效應
上文中提到hPL培養的TN和TCM亞群在抗原刺激下比TE具有更高的增殖能力[1C和1D]。因此，實驗人員用CellTrace Violet染料(CTV)標記每種實驗條件下的P28z或1928z T細胞，然后分別用Capan-1PSCA或NALM6細胞刺激它們。培養5天后，我們基于CTV稀釋和CAR - T細胞凋亡(Annexin V和7AAD染色)評估細胞增殖。如圖3a所示，hPL擴增的P28z和1928z T細胞在抗原刺激下細胞分裂數量顯著增加，凋亡減少(P28z - Annexin V+凋亡細胞:FBS - 52.1±7.2%，ABS - 59.4±2.9%，hPL- 26.7±3.4%，平均±S.E. n = 5;1928z - FBS - 80.0±2.4%，ABS - 74.9±1.7%，hPL - 41.3±2.9%，平均±標準差，n = 5)(圖3b)。
圖3a&3b：FBS/ABS/hPL組CAR - T細胞增殖和抗腫瘤反應的影響：P28z或1928z T細胞用CTV染色，分別與Capan-1PSCA或NALM6共培養5天，使用CellTrace Violet (CTV)進行細胞增殖試驗和檢測凋亡細胞。
由(you)(you)于本次研究中觀(guan)察到(dao)hPL擴(kuo)增(zeng)的(de)CAR - T細(xi)(xi)胞(bao)的(de)短期(qi)細(xi)(xi)胞(bao)毒(du)性減弱但增(zeng)殖能(neng)力增(zeng)強，實驗(yan)人員接下來(lai)評(ping)估(gu)了(le)由(you)(you)細(xi)(xi)胞(bao)增(zeng)殖及其細(xi)(xi)胞(bao)毒(du)性效應主要影響(xiang)的(de)T細(xi)(xi)胞(bao)治療(liao)的(de)長期(qi)體(ti)外抗腫(zhong)瘤效果(guo)。因此(ci)繼續進行(xing)了(le)一個(ge)9天的(de)體(ti)外共培(pei)養(yang)實驗(yan)，同時(shi)監測(ce)腫(zhong)瘤細(xi)(xi)胞(bao)的(de)殺(sha)傷(shang)和T細(xi)(xi)胞(bao)的(de)擴(kuo)增(zeng)情(qing)況。
P28z T細胞與Capan-1PSCA共培養結束時，hPL培養的P28z T細胞具有較強的抗腫瘤活性，各組的詳細數據為：1）腫瘤細胞倍增率：FBS - 1.4±0.5,ABS - 1.9±0.8,hPL- 0.4±0.2，平均±S.E. n = 6；T細胞倍增率：T細胞倍增率:FBS - 5.6±3.2,ABS - 5.7±1.7,hPL- 24.7±3.7，平均±S.E. n = 6)(圖3c)。
圖3c&d：體外長期共培養實驗-P28z T細胞與Capan-1PSCA細胞共培養(c)或1928z T細胞與NALM6細胞共培養(d) 9天，每3天收集細胞，用流式細胞儀計數。
同(tong)樣地(di)，hPL培養的1928z T細胞比其他血清(qing)條(tiao)件下的增殖更(geng)快、更(geng)健壯，第(di)3天細胞擴增情況數(shu)據為(wei)：FBS - 1.8±0.3,ABS - 1.8±0.3,hPL - 3.4±0.3，平均±S.E. n = 6，第(di)9天NALM6消除的數(shu)據為(wei)：腫瘤細胞擴增倍數(shu):FBS - 15.5±10.0,ABS - 20.2±14.7,hPL - 0.06±0.03，平均±S.E. n = 6)(圖3d)。
總之，長期體外T細胞與腫瘤細胞共培養實驗中，由于hPL培養的CAR - T細胞更高的增殖能力其整體殺傷腫瘤效果優于在FBS或ABS中擴增的CAR - T細胞。
3-1 hPL擴增(zeng)的P28z T細胞(bao)在體(ti)內抗(kang)腫瘤作用增(zeng)強
為了評估在不同人血衍生物作為補充劑的培養條件下的CAR - T細胞在體內的抗腫瘤作用，我們將Capan-1PSCA細胞移植到小鼠體內，然后在腫瘤達到100mm3(大概腫瘤植入后21天的預估尺寸)時，靜脈注射GFP/ FL標記的P28z T細胞(圖4a)。有趣的是無論培養條件如何，我們觀察到腫瘤部位P28z T細胞的擴增水平相似(圖4b)。然而，當我們通過caliper測量評估每只小鼠的最大抗腫瘤反應時(從T細胞治療后的第10天到第35天)，hPL培養組的P28z T細胞治療的動物有更好治療結果(hPL;38 + 22 mm3, 9/12無腫瘤，FBS;81 + 19 mm3, 1/12無腫瘤，ABS;104 + 27 mm3, 2/12無腫瘤，平均+下頜骨，n =12)(圖4c)。在CAR - T細胞治療后的第112天跟蹤各組腫瘤復發情況，發現3只小鼠仍然沒有腫瘤(圖4d和e)，而那些復發的小鼠在稍后復發，是抗原陰性復發的結果(附加文件2:圖S4)。
圖5 P28z T細胞持久性及對腫瘤再發模型的抗腫瘤作用
進一步研究在體內hPL培養組的細胞是否表現出更好的持久性和保護能力，實驗人員進行了一個腫瘤復發模型實驗，在該模型中對清除原發腫瘤的小鼠[在給藥高劑量T細胞(2 × 106個T細胞/只小鼠)后，在對側腹部用移植入相同的腫瘤細胞 (圖5a)。在CAR - T細胞治療42天后，我們觀察到大多數動物已經消除了它們的原發腫瘤(FBS;5/5, ABS;5/6, hPL, 6/6)(圖5b，灰色背景)。如圖5b(淺綠色背景)所示: P28z (hPL) T細胞處理的小鼠腫瘤生長延遲 (2/6)或完全消除腫瘤(2/6) ，而P28z (FBS) T細胞處理的小鼠僅1/4小鼠腫瘤生長延遲 ，而P28z (ABS)小鼠則無對照區別。我們還正式評估了T細胞在腫瘤再發模型實驗中的持久性，并發現P28z (hPL) T細胞的生物發光顯著更高(圖5c)，表明原發腫瘤消除后的維持的持久性更長。這些P28z T細胞能夠遷移到新的腫瘤部位擴增并產生細胞毒性(圖5d和5e)，從而延緩腫瘤生長或完全消除腫瘤。
3-2 ;hPL擴增的1928z T細(xi)胞在體(ti)內表現出更高(gao)的增殖能力和(he)消除NALM6腫瘤能力
為了研究hPL培養的CAR- T細胞的抗腫瘤效果是否超出了Capan-1PSCA模型，研究者繼續進行了第二個異種移植小鼠模型，通過GFP/FL+ NALM6細胞移植小鼠(i.v)，然后(3天后)輸注1928z T細胞(5 × 106細胞/小鼠，i.v)(圖6a)。結果發現使用FBS或ABS培養的細胞治療的小鼠在隨后不久復發，而使用hPL法培養的CAR - T細胞治療的小鼠產生了較長的無瘤生存期(圖6c和d)，這與T細胞治療后第8天和第13天的優勢T細胞數量有關(圖6e)。由于NALM6腫瘤細胞優先定位于骨髓和次生淋巴樣器官(圖6b)，實驗者也通過將GFP/FL轉導的1928z T細胞輸注到NALM6小鼠中來追蹤T細胞的遷移和擴增情況(圖6f)。
圖6 1928z T細(xi)胞在(zai)FBS/ABS/hPL中擴增后(hou)的體內表現
如(ru)圖(tu)6g所示，1928z (hPL) T細(xi)胞(bao)在疾病部位(wei)快(kuai)速(su)而(er)健壯(zhuang)地(di)擴增，并(bing)且比FBS或(huo)ABS中1928z T細(xi)胞(bao)擴增的(de)時間更長(圖(tu)6h)。這些(xie)發現在高T細(xi)胞(bao)劑量下得到(dao)了(le)重現(附加文件2:圖(tu)S6)。總之這些(xie)數(shu)據(ju)表明CAR - T細(xi)胞(bao)在hPL中的(de)體(ti)外(wai)擴增中增強了(le)CAR - T細(xi)胞(bao)的(de)功能。
結論
與FBS或(huo)ABS相比，hPL培養(yang)體系(xi)的(de)(de)CAR - T細(xi)胞表現(xian)出高增(zeng)殖(zhi)能力和增(zeng)強的(de)(de)長期(qi)體內(nei)持(chi)久性，從而產(chan)(chan)生優(you)越的(de)(de)抗(kang)腫瘤效果。這些(xie)數據(ju)證明了hPL可用于制備臨(lin)床(chuang)級別(bie)的(de)(de)CAR - T細(xi)胞產(chan)(chan)品(pin)供(gong)患者治(zhi)療使(shi)用。值得注意的(de)(de)是，hPL來自(zi)多(duo)個(ge)可輸血供(gong)者的(de)(de)血小板，最初(chu)開發的(de)(de)目(mu)的(de)(de)是支持(chi)MSCs的(de)(de)體外擴增(zeng)，用于臨(lin)床(chuang)包(bao)括GVHD、克羅恩病(bing)、肌萎(wei)縮性側側癥和多(duo)發性硬(ying)化癥等一系(xi)列自(zi)身免疫(yi)性疾(ji)病(bing)的(de)(de)治(zhi)療。因此這篇研究是早(zao)期(qi)第一批評估hPL作為培養(yang)基補(bu)充(chong)劑對CAR - T細(xi)胞表型或(huo)功(gong)能影響的(de)(de)研究之一。
美(mei)國Sexton公司無動物源無需(xu)添加肝(gan)素的人血小板裂(lie)解(jie)液(ye)(ye),既(ji)提供(gong)經典的Stemulate血替(ti)產(chan)品(pin)滿足干細(xi)(xi)胞(bao)治療(liao)用(yong)戶科(ke)研(yan)和臨床(chuang)(chuang)(chuang)以及(ji)GMP生(sheng)產(chan)需(xu)求，又針對免疫細(xi)(xi)胞(bao)治療(liao)提供(gong)病原(yuan)體去除(chu)（Pathogen Reduced,PR）工藝的臨床(chuang)(chuang)(chuang)級nLiven和袋裝(zhuang)封閉系統T-Liven血小板裂(lie)解(jie)液(ye)(ye)產(chan)品(pin)滿足兼顧(gu)細(xi)(xi)胞(bao)治療(liao)安全(quan)和性(xing)能(neng)的需(xu)求，所有產(chan)品(pin)符合質量和監管要求且已在FDA已經備案藥物主文件，是全(quan)球(qiu)臨床(chuang)(chuang)(chuang)干細(xi)(xi)胞(bao)和免疫治療(liao)應用(yong)中用(yong)作高性(xing)能(neng)FBS/ABS替(ti)代品(pin)。
nLiven PR-涉及PR病原體去除工藝的hPL-免疫(yi)細胞治療用
T-Liven PR：涉及PR病(bing)原(yuan)體去除工藝的(de)封閉(bi)袋裝系統的(de)hPL
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