非分段負義RNA病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)，包(bao)括呼吸道合胞(bao)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)（RSV）、人副流感病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)（PIVs）、狂犬病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)（RABV）以及肺(fei)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)，可引起人類(lei)和(he)動物(wu)的呼吸道感染等癥狀，是人類(lei)面臨的一大(da)健康難題(ti)，因(yin)此需要開發病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)疫苗以及藥(yao)物(wu)研究以提高人民生活質(zhi)量。目前(qian)，帶有(you)報告基(ji)因(yin)的基(ji)因(yin)工程毒(du)(du)(du)株在疫苗開發和(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)藥(yao)物(wu)開發過(guo)程中發揮重(zhong)要作用(yong)。

一、帶有報告基因的呼吸道合胞病毒(RSV)

人類呼吸(xi)道合胞病毒(du)（RSV）是一種(zhong)包膜(mo)非分段負義單鏈RNA病毒(du)，屬于副粘(zhan)病毒(du)科(ke)肺(fei)(fei)炎(yan)病毒(du)亞科(ke)的(de)肺(fei)(fei)病毒(du)屬。RSV基因組長度約為15.2kb，包含10個開放閱讀(du)框(ORF)，編碼11種(zhong)蛋白(bai)質(zhi)，9個結構蛋白(bai)和2個非結構蛋白(bai)，對致病性(xing)和免疫逃逸十(shi)分重要。

呼(hu)吸(xi)(xi)道合胞病(bing)(bing)毒(du)（RSV）是導致(zhi)全球嬰幼兒急性(xing)和重度下呼(hu)吸(xi)(xi)道疾病(bing)(bing)的常見病(bing)(bing)毒(du)之一，目前尚無針(zhen)對RSV感染的有(you)效藥物，現有(you)治療藥物僅能(neng)緩解(jie)癥狀。伴隨(sui)2023年GSK、輝瑞的RSV疫(yi)苗(miao)(miao)接連獲批(pi)上市(shi)，RSV疫(yi)苗(miao)(miao)以(yi)及藥物開發(fa)研究已(yi)成為(wei)熱點。

隨(sui)著反向遺傳學以及(ji)合成生物學的(de)發(fa)展，通過基因(yin)工程(cheng)改(gai)造的(de)毒(du)株能夠(gou)更好的(de)控(kong)制病毒(du)的(de)復制來提(ti)高疫(yi)苗的(de)安全性，以及(ji)誘發(fa)機(ji)體產生強烈免(mian)疫(yi)反應(ying)。如通過在不同位點插入不同類(lei)型(xing)的(de)基因(yin)，獲得(de)表達具有GFP、RFP、Luc5的(de)一(yi)代(dai)病毒(du)。比如在一(yi)代(dai)RSV-GFP病毒(du)中，將GFP基因(yin)作為第一(yi)基因(yin)插入NS1基因(yin)前(qian)面進行改(gai)造中，發(fa)現RSV的(de)主要靶細(xi)胞類(lei)型(xing)是人類(lei)氣道(dao)中的(de)纖毛上皮細(xi)胞。

圖1：一代(dai)RSV病毒--具(ju)有(you)綠色熒(ying)光蛋白的人呼吸道合(he)胞病毒 （RSV-GFP1）

特點：

01   菌株插(cha)入類型：菌株A2

02   插入位點：GFP作為第(di)1個基(ji)因插入NS1基(ji)因前面

03   生(sheng)產和傳代方式：分離(li)株(zhu)在HEp-2細胞中繁殖

04   感染性(xing)：滴度>6.0 log10 TCID50/mL，對人(ren)類(lei)具(ju)有傳染性(xing)

05   體積/存儲：每個冷凍管2x1.2mL，儲存在-80oC下

06   質量測試(shi)：未檢測到細菌、真菌或支原體

07   內(nei)毒素(su)含量(liang)：內(nei)毒素(su)<10 EU/mL

此(ci)外(wai)，還有DsRed2、FarRed5的(de)呼(hu)吸道合胞二(er)代(dai)病(bing)(bing)毒亞(ya)型。二(er)代(dai)病(bing)(bing)毒將報(bao)告基因插(cha)入P和M之間，避免對NS基因的(de)表(biao)達影響(xiang)，從而使(shi)這些(xie)新型毒株滿足各種條件下的(de)研究需求。如改造后含有 mKate2 遠紅熒光(guang)蛋白(bai)的(de)呼(hu)吸道合胞病(bing)(bing)毒 （RSV-FarRed5）。高亮度(du)、遠紅外(wai)發射光(guang)譜、出色(se)(se)的(de)pH值(zhi)耐(nai)性(xing)(xing)和光(guang)穩定(ding)性(xing)(xing)，加上低毒性(xing)(xing)的(de)特點，mKate2 成為活體組織(zhi)成像(xiang)的(de)優質熒光(guang)報(bao)告基因，使(shi)改進后的(de)RSV-FarRed5可以(yi)用(yong)于多色(se)(se)應用(yong)以(yi)及全身成像(xiang)。

圖2：二代RSV病毒(du)--含(han)有mKate2遠紅熒光蛋白的(de)呼吸道合(he)胞病毒(du) （RSV-FarRed5）

特點：

01   菌株插入(ru)類(lei)型：菌株A2

02   插(cha)(cha)入位點：mKate2作為(wei)第五個基因(yin)插(cha)(cha)入P和M之間

03   生產和傳代方式：分離株在(zai)HEp-2細胞（ATCC CCL-23）中繁殖

04   感(gan)染性：滴度>6.5 log10 TCID50/mL

05&nbsp;  體積/存(cun)儲：每個冷(leng)凍(dong)管2x1.2mL，儲存(cun)在-80oC下

06   質量測(ce)試：未檢測(ce)到細菌(jun)、真菌(jun)或支原體

07   內(nei)毒素含量：內(nei)毒素<10 EU/mL

那么，基因工(gong)程改造(zao)毒(du)株在生命科(ke)學研(yan)究(jiu)中可以發(fa)揮什(shen)么功能及作用呢？

二、基因工程改造毒株在疫苗研發中的作用

1   監測病毒復制和傳播

引入(ru)報告(gao)基(ji)(ji)因(yin)后可以追(zhui)蹤(zong)病毒在體內的(de)(de)復制和(he)傳播(bo)(bo)情況。通(tong)過觀察報告(gao)基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)表達(da)情況，可以評估病毒感(gan)染的(de)(de)程(cheng)度、病毒在不(bu)同組織(zhi)和(he)細(xi)胞(bao)類型中的(de)(de)定位，以及病毒的(de)(de)傳播(bo)(bo)路徑。

2   評估病毒免疫原性

引(yin)入(ru)報告(gao)基因(yin)后(hou)可以幫助(zhu)研究人員(yuan)評估病毒疫(yi)苗的免疫(yi)原性(xing)。觀察報告(gao)基因(yin)的表達水平和(he)持續時間可以提供關于疫(yi)苗誘導(dao)的免疫(yi)反應(ying)的信息(xi)，包括病毒的抗(kang)原特異性(xing)和(he)免疫(yi)記(ji)憶效應(ying)。

3   評估病毒疫苗的安全性

引(yin)入報告基因(yin)后可(ke)以用于評估(gu)病(bing)毒疫(yi)(yi)苗(miao)的安全性。通過觀察報告基因(yin)的表達情況和組(zu)織分布(bu)，可(ke)以評估(gu)疫(yi)(yi)苗(miao)病(bing)毒是否(fou)引(yin)起了異常的病(bing)理(li)反(fan)應或(huo)組(zu)織損(sun)傷。

4   評估病毒疫苗的有效性

引(yin)入(ru)報(bao)告(gao)基(ji)因(yin)后可以幫助評估疫苗的(de)有效(xiao)性。通過觀察報(bao)告(gao)基(ji)因(yin)的(de)表(biao)達(da)情(qing)況和病毒感(gan)染的(de)臨(lin)床結果，可以評估疫苗的(de)保護效(xiao)果和預防(fang)感(gan)染的(de)能力。

三、基因工程改造毒株在藥物開發中的作用

1   病毒復制和傳播的評估

報(bao)告基(ji)因的(de)(de)引入使得研究人員可(ke)以追蹤病(bing)毒(du)在(zai)細胞(bao)中(zhong)的(de)(de)復(fu)制(zhi)和(he)傳(chuan)(chuan)播情況。通過觀察報(bao)告基(ji)因的(de)(de)表達水平和(he)分布，可(ke)以評估(gu)潛在(zai)藥物(wu)對病(bing)毒(du)復(fu)制(zhi)和(he)傳(chuan)(chuan)播的(de)(de)影響，為篩選和(he)優化病(bing)毒(du)抑制(zhi)劑提(ti)供(gong)重(zhong)要(yao)信(xin)息(xi)。

2   藥物研發的篩選平臺

帶有報告(gao)基因(yin)(yin)的病(bing)毒(du)可以(yi)(yi)作為藥物(wu)(wu)(wu)研發(fa)(fa)的篩選平臺。通過將報告(gao)基因(yin)(yin)與病(bing)毒(du)復制(zhi)(zhi)關(guan)鍵基因(yin)(yin)或復制(zhi)(zhi)過程相關(guan)基因(yin)(yin)相連，可以(yi)(yi)構(gou)建(jian)用于(yu)篩選抗病(bing)毒(du)藥物(wu)(wu)(wu)的細胞或動物(wu)(wu)(wu)模(mo)型(xing)。這(zhe)些模(mo)型(xing)可以(yi)(yi)用于(yu)評估潛在藥物(wu)(wu)(wu)的抗病(bing)毒(du)活性和毒(du)副作用，加速藥物(wu)(wu)(wu)研發(fa)(fa)的進(jin)程。

3   藥物的靶向和效果評估

帶有報告基(ji)因的病(bing)(bing)毒還可(ke)以(yi)用于評(ping)估藥(yao)物的靶向(xiang)和(he)效果。通過(guo)觀察(cha)報告基(ji)因的表(biao)達情況和(he)病(bing)(bing)毒復(fu)制(zhi)的抑(yi)制(zhi)程度(du)，可(ke)以(yi)評(ping)估藥(yao)物對病(bing)(bing)毒的靶向(xiang)性(xing)和(he)特異性(xing)，以(yi)及藥(yao)物對病(bing)(bing)毒復(fu)制(zhi)和(he)傳播(bo)的抑(yi)制(zhi)效果。

4   毒性和安全性評估

在藥(yao)物(wu)開發過程中，帶有報告基因的(de)病毒(du)(du)還(huan)可(ke)以用于評(ping)估(gu)藥(yao)物(wu)的(de)毒(du)(du)性(xing)和(he)(he)安(an)全性(xing)。通過觀察報告基因的(de)表達情況和(he)(he)細(xi)胞或動物(wu)的(de)生理(li)狀(zhuang)態，可(ke)以評(ping)估(gu)藥(yao)物(wu)對宿主細(xi)胞和(he)(he)組織的(de)影響(xiang)，從而評(ping)估(gu)藥(yao)物(wu)的(de)毒(du)(du)性(xing)和(he)(he)安(an)全性(xing)。

四、品牌簡介 

Viratree是一家專注于病(bing)毒(du)(du)學試劑盒和服務(wu)的(de)(de)美國(guo)公司，通過(guo)基因工程改造，提(ti)供帶有GPF/RFP或者其他報告基因的(de)(de)基因工程呼(hu)吸(xi)道合(he)胞(bao)(bao)病(bing)毒(du)(du)(RSV)、人副流感(gan)病(bing)毒(du)(du)(PIV)，肺炎病(bing)毒(du)(du)等，這些新型病(bing)毒(du)(du)可以幫助科研人員研究病(bing)毒(du)(du)感(gan)染的(de)(de)各(ge)個(ge)方(fang)面，包括(kuo)病(bing)毒(du)(du)的(de)(de)熱帶性、病(bing)毒(du)(du)感(gan)染的(de)(de)細胞(bao)(bao)命運(yun)、疫苗策略(lve)和抗病(bing)毒(du)(du)治(zhi)療。

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