發布時間：2022/08/22 點擊數：1120 一、前言
T細(xi)胞(bao)(bao)療法包括CAR-T和TCR-T等已成為一種高效(xiao)的(de)新(xin)型治(zhi)療腫(zhong)瘤(liu)尤其(qi)是血液瘤(liu)的(de)方法。以往細(xi)胞(bao)(bao)治(zhi)療的(de)治(zhi)療劑量是根據呈(cheng)遞相關表(biao)面抗原的(de)細(xi)胞(bao)(bao)總數來計算的(de)，希望(wang)這些細(xi)胞(bao)(bao)的(de)部(bu)分群體能夠在移(yi)植到病人體內表(biao)現出持(chi)久的(de)效(xiao)應(ying)反應(ying)。最近的(de)研究表(biao)明呈(cheng)現中(zhong)央記憶表(biao)型的(de)T細(xi)胞(bao)(bao)在多種疾病模型中(zhong)會提高效(xiao)應(ying)表(biao)型的(de)療效(xiao)[文獻(xian)1]。
如圖1所示，TCM是(shi)中央記憶(yi)型(xing)T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（Central Memory T cell）的(de)簡稱，是(shi)初始T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（Naive T Cell）經過抗(kang)原(yuan)激活后，產(chan)生的(de)具有(you)長期(qi)記憶(yi)性的(de)，并(bing)能夠歸(gui)巢到淋巴結接受抗(kang)原(yuan)再刺(ci)激的(de)T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。被激活的(de)TCM細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，在抗(kang)原(yuan)的(de)再次刺(ci)激之下，可(ke)繼續產(chan)生大量的(de)攜帶同種抗(kang)原(yuan)的(de)克(ke)隆化的(de)效(xiao)應記憶(yi)型(xing)T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。因此TCM細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)因其歸(gui)巢性、記憶(yi)性、持(chi)久(jiu)性以(yi)及擴增(zeng)性等抗(kang)腫(zhong)瘤的(de)特(te)點，相對于以(yi)效(xiao)應T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)為主成分的(de)免疫細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)治療生物制品具備一定(ding)的(de)預防(fang)/抗(kang)腫(zhong)瘤和(he)治療腫(zhong)瘤雙(shuang)重作用的(de)優勢。
圖(tu)1 中央(yang)記(ji)憶T細胞TCM的分化由來
免疫治療用細(xi)(xi)胞體(ti)外培養(yang)(yang)體(ti)系尤其(qi)是(shi)培養(yang)(yang)基補(bu)充劑的(de)(de)(de)(de)可(ke)持續性(xing)穩定供(gong)應(ying)是(shi)諸(zhu)多生物醫藥企業(ye)密切關注(zhu)的(de)(de)(de)(de)問(wen)題之(zhi)一(yi)(yi)。細(xi)(xi)胞治療行業(ye)的(de)(de)(de)(de)迅速發展給(gei)傳(chuan)統的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞培養(yang)(yang)物料的(de)(de)(de)(de)傳(chuan)統供(gong)應(ying)鏈帶來了壓力，胎牛(niu)血清作為一(yi)(yi)種動物衍生試(shi)劑在(zai)監管方(fang)面(mian)存在(zai)重大問(wen)題，因(yin)此研究(jiu)人員在(zai)很(hen)大程(cheng)(cheng)度上依賴(lai)于人類 AB血清作為一(yi)(yi)種特(te)殊(shu)的(de)(de)(de)(de)蛋白質(zhi)、激素(su)和(he)細(xi)(xi)胞因(yin)子(zi)混合的(de)(de)(de)(de)補(bu)充來源，以此促進(jin)T細(xi)(xi)胞制造過程(cheng)(cheng)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)生長。然而人AB血清除了本身(shen)原材(cai)料對于供(gong)體(ti)選擇的(de)(de)(de)(de)限制性(xing)問(wen)題，在(zai)能否保持細(xi)(xi)胞特(te)定表型(xing)或(huo)重要特(te)性(xing)的(de)(de)(de)(de)情(qing)況(kuang)下能否比(bi)FBS更能促進(jin)細(xi)(xi)胞增殖的(de)(de)(de)(de)作用是(shi)有爭議的(de)(de)(de)(de)[文(wen)獻2]。
人血(xue)小板裂解液Human Platelet Lysate （hPL)是作(zuo)為胎牛血(xue)清、人AB血(xue)清的替代性(xing)的培養(yang)基補充劑(ji)，hPL是將(jiang)人的血(xue)小板進一步裂解后所獲得的液體成分，其中含有(you)多種生(sheng)物活性(xing)因(yin)子(zi)（如圖2）。
圖2 血小板(ban)裂解液hPL組成(cheng)成(cheng)分(fen)
日立(li)先進治療方案(an)公司(si)(HCATS)和(he)(he)美國Sexton生(sheng)物技術公司(si)合作將人血(xue)(xue)小(xiao)板(ban)裂解液nLiven PR與人AB血(xue)(xue)清(ABS)作為兩種免疫細(xi)胞(bao)(bao)(bao)治療用(yong)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)培養基補充劑在對T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)記憶(yi)表型(xing)和(he)(he)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)擴增性能(neng)影響差異進行了(le)小(xiao)規(gui)模評估(gu)，以期研究如何(he)幫助細(xi)胞(bao)(bao)(bao)治療的生(sheng)物醫藥(yao)企(qi)業提高細(xi)胞(bao)(bao)(bao)治療用(yong)的細(xi)胞(bao)(bao)(bao)質量和(he)(he)增加(jia)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)穩(wen)定供應。
二、T細(xi)胞(bao)培養擴增(zeng)以及(ji)TCM表型實驗
1、hPL與(yu)ABS對(dui)細胞(bao)擴(kuo)增群體(ti)效果比較(jiao)
從兩(liang)個供(gong)體獲得外周(zhou)血單個核細(xi)(xi)胞(PBMCs)，用CD3/CD28 T細(xi)(xi)胞激活劑后在(zai)(zai)(zai)靜態(tai)培(pei)養瓶條(tiao)件下培(pei)養14天(tian)。總的(de)來(lai)說(shuo)，在(zai)(zai)(zai)培(pei)養第(di)8天(tian)時(shi)總PBMCs細(xi)(xi)胞數擴(kuo)(kuo)增(zeng)沒有明(ming)顯(xian)(xian)變化，然而(er)在(zai)(zai)(zai)第(di)10天(tian)使用nLiven PR的(de)培(pei)養組在(zai)(zai)(zai)兩(liang)個供(gong)體中(zhong)都顯(xian)(xian)示(shi)出(chu)明(ming)顯(xian)(xian)高于(yu)ABS的(de)擴(kuo)(kuo)增(zeng)效果（圖(tu)3）。并且對于(yu)第(di)8天(tian)細(xi)(xi)胞樣(yang)本進行(xing)的(de)FACS分析，其中(zhong)nLiven PR組中(zhong)CD3+細(xi)(xi)胞亞(ya)群(qun)比例增(zeng)加到98.2% ± 0.24%（供(gong)體1） 和(he) 97.6± 0.26%（供(gong)體2），而(er)ABS組CD3+細(xi)(xi)胞亞(ya)群(qun)比例分別為94.8%±0.63%和(he)91.9%±1.47%。因此可初步大(da)致判斷(duan)nLiven組相對ABS組的(de)PBMCs總擴(kuo)(kuo)增(zeng)群(qun)體增(zeng)加的(de)原因是由于(yu)T細(xi)(xi)胞亞(ya)群(qun)為主擴(kuo)(kuo)增(zeng)的(de)促進。
圖3：兩名捐贈者的 PBMCs 在以 ABS 和(he) hPL 作為培養補(bu)充劑的擴增(zeng)對比
培養10天后均實現(xian)了統計學上顯(xian)著的擴張(zhang)
2、hPL與ABS對(dui)細(xi)胞擴增時TCM細(xi)胞亞群影響的比較(jiao)
在前言中(zhong)，我們已知TCM的定量(liang)化的監測為(wei)臨床規范化治療(liao)提供參考指標，通過細(xi)胞制(zhi)(zhi)劑中(zhong)最終(zhong)TCM亞群(qun)而不是總T細(xi)胞產(chan)量(liang)來評(ping)估培(pei)養效果提供更(geng)現實的治療(liao)相關性參考，因此可以說(shuo)良好TCM表型(xing)的T細(xi)胞群(qun)體也是評(ping)估細(xi)胞治療(liao)制(zhi)(zhi)劑的產(chan)量(liang)有效且(qie)重(zhong)要的參考方面。
一(yi)般(ban)而言(yan)TCM細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)亞(ya)群(qun)的(de)(de)(de)(de)百分比通常與(yu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)群(qun)體(ti)(ti)(ti)翻(fan)倍(bei)的(de)(de)(de)(de)次(ci)數呈負相關（如圖4中(zhong)的(de)(de)(de)(de)ABS培(pei)(pei)養(yang)組），然(ran)而當在(zai)靜態(tai)培(pei)(pei)養(yang)瓶中(zhong)用nLiven PR培(pei)(pei)養(yang)時(shi)(shi)，與(yu)ABS組相比雖然(ran)實(shi)驗(yan)中(zhong)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)總產(chan)量相似(si)但是該TCM亞(ya)群(qun)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)在(zai)統(tong)計上(shang)有(you)顯(xian)著增加(見圖4)，由此推斷(duan)nLiven PR條件下生(sheng)產(chan)的(de)(de)(de)(de)高質(zhi)量、有(you)效的(de)(de)(de)(de)TCM細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)數量更多。這也再次(ci)驗(yan)證了實(shi)驗(yan)1中(zhong)得出的(de)(de)(de)(de)結論：無論不同的(de)(de)(de)(de)供(gong)體(ti)(ti)(ti)PBMCs中(zhong)TCM的(de)(de)(de)(de)起(qi)始(shi)濃度百分比是多少，14天培(pei)(pei)養(yang)期結束時(shi)(shi)有(you)大約30%的(de)(de)(de)(de)T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)群(qun)體(ti)(ti)(ti)為TCM（起(qi)始(shi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)為PBMCs） ，但同樣利用ABS培(pei)(pei)養(yang)的(de)(de)(de)(de) PBMCs擴(kuo)增的(de)(de)(de)(de)同時(shi)(shi)則會導致TCM群(qun)體(ti)(ti)(ti)顯(xian)著減少。
圖4：來自6個獨立供(gong)體(ti)實驗(yan)的數據在靜態培(pei)養瓶(ping)中擴(kuo)增顯示
nLiven PR在培養14天(tian)后持續增加(jia)PBMCs中(zhong)總的中(zhong)央記憶(yi)T細胞比例
下圖5種展示的(de)(de)是起(qi)始(shi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)選用來自(zi)三個(ge)供(gong)體(ti)的(de)(de)CD3+陽性的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，在結束(shu)培養期(qi)時約50%的(de)(de)T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)亞群(qun)為(wei)TCM。nLiven組與ABS組相比，兩名(ming)供(gong)體(ti)的(de)(de)PBMCs細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)培養后TCM細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)亞群(qun)有統計(ji)學意義的(de)(de)顯著增加(jia)。
圖(tu)5：三個供體的(de)(de)CD3+陽性(xing)的(de)(de)細胞用hPL和(he)AB血清擴增后TCM的(de)(de)比例
用nLiven PR培養的T細胞在體外擴增實驗中，其TCM細胞亞群的增加結果趨勢是明確且保持一致的，這與添加AB血清培養獲得的T細胞包括增效果隨之而來的TCM亞群比例降低的這種現象即原代人T細胞擴增的驅動向效應表型分化的預期相反，這表明nLiven PR的作為T細胞培養基補充劑的加入有選擇性地促進了在整個體外培養過程中TCM表型的維持。
3、hPL與ABS對T細(xi)胞(bao)治療起始材料差異性(xing)影響的(de)比(bi)較
緊接(jie)著(zhu)研究人員在(zai)放大的(de)(de)(de)攪(jiao)拌培養系統中評估使用(yong)nLiven替代ABS作為培養補(bu)充劑的(de)(de)(de)持續影(ying)響(xiang)，主要操作是：對于來(lai)自(zi)三(san)(san)(san)個(ge)供(gong)體(ti)的(de)(de)(de)CD3+起(qi)(qi)始細胞亞群，用(yong)Dynabeads-Activator CD3/CD28 激(ji)活處理后，在(zai)攪(jiao)拌式生物反應器(qi)中培養11天。發現nLiven PR和ABS兩(liang)(liang)組(zu)的(de)(de)(de)所有(you)三(san)(san)(san)個(ge)供(gong)體(ti)的(de)(de)(de)平(ping)均細胞群的(de)(de)(de)翻(fan)倍分別(bie)為6.1±0.58和6.0±1.37 (圖6)。因此(ci)該實(shi)驗中nLiven和ABS兩(liang)(liang)組(zu)總T細胞群體(ti)擴增沒有(you)統計(ji)學上的(de)(de)(de)顯著(zhu)變化。然而當關注到這三(san)(san)(san)組(zu)間供(gong)體(ti)來(lai)源起(qi)(qi)始細胞群體(ti)CD3+之間的(de)(de)(de)差(cha)(cha)異性，nLiven PR組(zu)的(de)(de)(de)變異系數為10%，而ABS組(zu)為23%，由此(ci)表明nLiven PR組(zu)的(de)(de)(de)供(gong)體(ti)間變異顯著(zhu)降低(di)，后面的(de)(de)(de)實(shi)驗也在(zai)這兩(liang)(liang)組(zu)不同供(gong)體(ti)間的(de)(de)(de)對比(bi)實(shi)驗發現nLiven血(xue)小(xiao)板(ban)裂解(jie)液作為培養基補(bu)充可(ke)能會(hui)緩解(jie)因血(xue)小(xiao)板(ban)捐贈供(gong)體(ti)之間差(cha)(cha)異性帶(dai)來(lai)的(de)(de)(de)整體(ti)治療(liao)的(de)(de)(de)差(cha)(cha)異性影(ying)響(xiang)，降低(di)起(qi)(qi)始材料的(de)(de)(de)可(ke)變性，幫助開發者產生更(geng)好的(de)(de)(de)特征(zheng)治療(liao)。
圖6：3組供(gong)體來源的(de)T細胞(bao)擴增在ABS和hPL兩種組影響區別(bie)不大(da)
但nLiven PR組的(de)供體對供體變異(yi)顯著(zhu)較低
如何降(jiang)低批次之(zhi)間(jian)的差異是開發細(xi)胞治療制品一(yi)(yi)個主要考(kao)慮因素，作為人(ren)類血小板(ban)的裂解(jie)物(wu)(wu)nLiven比富集的人(ren)AB血清在生產制備工(gong)藝(yi)過程中涉(she)及生物(wu)(wu)化學物(wu)(wu)質的更(geng)為均勻的混合。這種差異可能是帶來細(xi)胞治療用(yong)細(xi)胞培(pei)養產生更(geng)為一(yi)(yi)致反應的原因之(zhi)一(yi)(yi)。
三(san)、結語
本次研(yan)究多個供(gong)(gong)實(shi)驗(yan)中(zhong)，nLiven PR的(de)培養組中(zhong)TCM表型得(de)(de)到促進即在PBMCs擴(kuo)增(zeng)(zeng)的(de)TCM細(xi)(xi)胞(bao)亞群顯著增(zeng)(zeng)加(jia)。而對于細(xi)(xi)胞(bao)制(zhi)(zhi)品(pin)轉化為臨床時(shi)關(guan)注的(de)捐贈供(gong)(gong)體的(de)一致性影響方面(mian)(mian)：與ABS相(xiang)比，當nLiven PR補(bu)充培養基進行與商業相(xiang)關(guan)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)培養擴(kuo)增(zeng)(zeng)實(shi)驗(yan)時(shi)，不同供(gong)(gong)體間獲(huo)得(de)(de)的(de)總細(xi)(xi)胞(bao)產(chan)量(liang)(liang)或中(zhong)央記憶表型TCM的(de)變異水平(ping)較低。從(cong)細(xi)(xi)胞(bao)制(zhi)(zhi)劑中(zhong)所(suo)用(yong)治療(liao)(liao)用(yong)細(xi)(xi)胞(bao)質量(liang)(liang)的(de)屬性，而不是細(xi)(xi)胞(bao)數量(liang)(liang)的(de)體積來評估產(chan)量(liang)(liang)方面(mian)(mian)，我(wo)們可以得(de)(de)出：nLiven 將PR應用(yong)到T細(xi)(xi)胞(bao)體外細(xi)(xi)胞(bao)制(zhi)(zhi)品(pin)的(de)制(zhi)(zhi)造過程中(zhong)可以獲(huo)得(de)(de)高質量(liang)(liang)的(de)治療(liao)(liao)用(yong)T細(xi)(xi)胞(bao)。
此外美國貝勒醫(yi)學院由 Norihiro Watanabe利(li)用(yong)胎牛(niu)血(xue)清(FBS)、人AB血(xue)清(ABS)和人血(xue)小板(ban)裂(lie)解液nLiven作(zuo)為培(pei)養(yang)基補充(chong)劑對T細胞記憶表型和治療療效的(de)影響進行了小規模評估，最終結果顯示：對比ABS和FBS，在(zai)nLiven中培(pei)養(yang)組實驗(yan)中，表現(xian)出中央記憶表型的(de)T細胞和總存活(huo)率(lv)在(zai)統(tong)計上顯著增加（圖7）[文獻3]。
圖(tu)7：相對(dui)于(yu)FBS和ABS，Sexton血(xue)小板裂解液(ye)T-Liven的(de)(de)擴(kuo)增效率更高，更有助于(yu)T細胞(bao)維持較低的(de)(de)分化水平(ping)狀態
美國Sexton公司無動物源無需添加肝素的人血小板裂解液,既提供經典的Stemulate滿足干細胞治療用戶科研和臨床以及GMP生產需求，又針對免疫細胞治療提供病原體去除（Pathogen Reduced,PR）工藝的臨床級nLiven和袋裝封閉系統T-Liven血小板裂解液產品。滿足質量和監管要求且已在FDA已經備案藥物主文件，是全球臨床干細胞和免疫治療應用中用作高性能FBS/ABS替代品。
封閉袋裝(zhuang)系統包(bao)裝(zhuang)形(xing)式的TLiven產品（經T細胞生長驗證(zheng)實驗）
美國Sexton品牌(pai) PR工藝
四(si)、參考文獻
1.Klebanoff CA, Gattinoni L, Torabi-Parizi P et al. Central memory self/tumor-reac-tive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. PNAS 2005; 102 (27): 9571–6.
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3.Torres Chavez A, McKenna MK, Canes?trari E et al. Expanding CAR T cells in human platelet lysate renders T cells with in vivo longevity. J. ImmunoTher. Cancer 2019; 7: 330.
