發布時間：2023/11/17 點擊數：981 前言
聚乙烯亞胺 (Polyethylenimine, PEI) 是一種水溶性陽離子高分子聚合物, 每相隔兩個碳原子，即每第三個原子都是質子化的氨基氮原子，使得聚合物網絡在任何 pH 下都能充當有效的質子海綿體, 早在1995年被用于體外核酸轉染。帶正電荷的PEI利用靜電交互作用縮聚帶負電的核酸并形成易被細胞攝取的正電小粒徑復合體, 這種凝聚核酸的能力極大地影響著轉染效率。目前市面上有多種不同類型的PEI轉染試劑，但大多只是在PEI的某些特殊的結構、分子量等方面稍有不同，其基本原理基本一致，即借助PEI所含的大量胺基具有質子海綿效應, 促使PEI-核酸復合物逃離出內涵體和溶酶體繼而在胞內釋放核酸使目的基因得以表達。
Polysciences PEI
Polysciences PEI轉染試劑因其較高的轉染效果，已被應用于(yu) AAV、LV 和重(zhong)組蛋白(bai)等工業(ye)化生產，成(cheng)(cheng)為大多數科學工作者、生物技術公司的主流方式(shi)。Polysciences 成(cheng)(cheng)立于(yu)1961年，公司提供(gong)一系(xi)列 PEI 產品(pin)，研究級產品(pin) PEI MAX 和 Transporter 5，以及 cGMP 級 MAXgene GMP，提供(gong)適合于(yu)任何規(gui)模 AAV、LV 病(bing)毒載體和重(zhong)組蛋白(bai)的制(zhi)造。
一直以來(lai)(lai)，轉(zhuan)染(ran)(ran)后生產的(de)(de)病毒滴度/蛋白(bai)產量(liang)是(shi)工業生產中(zhong)重要(yao)一環。但(dan)對于(yu)來(lai)(lai)源于(yu)不(bu)(bu)(bu)同(tong)客戶、不(bu)(bu)(bu)同(tong)的(de)(de)項目來(lai)(lai)說(shuo)，轉(zhuan)染(ran)(ran)后的(de)(de)產量(liang)往往卻參差不(bu)(bu)(bu)齊，這正是(shi)由于(yu)在(zai)轉(zhuan)染(ran)(ran)中(zhong)會有(you)多種條(tiao)(tiao)件會干擾轉(zhuan)染(ran)(ran)過程，影響(xiang)最終的(de)(de)產量(liang)。也正由于(yu)轉(zhuan)染(ran)(ran)過程中(zhong)多種條(tiao)(tiao)件都(dou)可能對最終的(de)(de)結果產生或多或少的(de)(de)影響(xiang)，因此需在(zai)不(bu)(bu)(bu)同(tong)的(de)(de)項目中(zhong)進行條(tiao)(tiao)件優(you)化。那(nei)么(me)今天就由小編(bian)給大家介紹一下(xia)在(zai)細(xi)胞轉(zhuan)染(ran)(ran)過程中(zhong)都(dou)有(you)哪(na)些條(tiao)(tiao)件可能影響(xiang)到最終的(de)(de)實(shi)驗(yan)結果。
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1、培養(yang)基(ji)配方：無血清，不影響轉染(ran)，能夠支持高密(mi)度(du)細胞生長(chang)
細胞培養基是鹽、碳水化合物、維生素、氨基酸、代謝前體、微量元素等形成的的復雜混合物。在進行細胞培養時，通常還需要加入一些添加物，例如血清、抗生素等，有時還需要根據培養需要加入一些特殊的生長因子。但對于不同細胞系/種類來說，培養他們時所需要的營養成分各不相同，因此選擇適合某一類/一種細胞的細胞培養基尤為重要。目前市面上有多種不同類型的培養基，包括用于常規貼壁培養的培養基和適用于無血清懸浮培養的培養基，例如OpiM-MEM無血清培養基、Freestyle293表達培養基、RPMI-1640、MEM、DMEM 高糖/低糖等。但有些培養基雖然能夠增加細胞活力，但卻對轉染及生產存在不利影響（圖1）。因此篩選一種合適的培養基是至關重要的。此外，對于使用Polysciences轉染試劑的客戶來說，小編建議您在進行轉染操作時，推薦使用如下表所示的培養基種類（表1）。
另外，血清是一種包含生長因子及其他輔助因子的不確切成分的添加物，對不同細胞的生長作用有很大的差別。血清質量的變化直接影響細胞生長，因此，選擇適合的血清種類也相當重要。由于血清中不確定成分/蛋白因子的存在，在轉染過程中可能會影響轉染效率，因此小編建議您在轉染前使用無血清或低血清（2%-5%）細胞培養基進行細胞培養。但是，如果選用培養基作為質粒DNA與PEI孵育時的稀釋液，在整個轉染復合體形成的過程中須嚴格限制血清的使用（應使用無血清培養基作為稀釋液），因為有些血清中的一些蛋白因子會阻礙質粒DNA與PEI的結合，導致轉染效率的下降。此外，對新加培養基進行預熱對細胞轉染很有幫助。
Fig.1 測試了五種不(bu)同培(pei)養(yang)(yang)基(ji)類(lei)型(xing)的(de)細胞生(sheng)長(chang)和AAV病毒產生(sheng)。所(suo)有培(pei)養(yang)(yang)基(ji)類(lei)型(xing)下細胞均呈指(zhi)數增長(chang)，其中培(pei)養(yang)(yang)基(ji)類(lei)型(xing)A的(de)細胞生(sheng)長(chang)和AAV產量(liang)最好。
2、培養(yang)(yang)(yang)空間(jian)：搖(yao)瓶中培養(yang)(yang)(yang)基(ji)總(zong)(zong)體(ti)(ti)積(ji)(ji)不超過培養(yang)(yang)(yang)瓶總(zong)(zong)體(ti)(ti)積(ji)(ji)的20%（總(zong)(zong)體(ti)(ti)積(ji)(ji) < 500 ml）或30%（總(zong)(zong)體(ti)(ti)積(ji)(ji) > 500 ml）
對于使用懸浮細胞進行蛋白/病毒生產來說，在進行大規模生產之前在小體積模型中進行條件摸索及優化是必不可少的一個環節。不少用戶會選擇在125/250/500 ml搖瓶中進行條件探索，一方面經濟節約，另一方面能夠快速得到大致的結論，但是在此過程中培養的總體積對產量的影響是經常被忽略的一點，往往會認為更大的培養體積有利于提升產量，然而當培養總體積過大時往往會導致后期培養瓶中營養匱乏，氧氣濃度不足以支撐細胞正常生長，造成細胞受損等，導致實驗屢屢受挫，結果難達預期。那么該如何選擇合適的培養體積以達到最大的生產效果呢？小編建議當使用總容量小于500ml的搖瓶時，細胞培養總體積不超過培養瓶總體積的20%，其中在15%-20%為宜；當培養瓶總容量大于500ml時，細胞培養總體積不超過培養瓶總體積的30%，其中維持在25%-30%為宜。
3、細胞(bao)：選用(yong)處于對數生長期，活力高，代次低（30代以(yi)內）的細胞(bao)進行轉染(ran)
細(xi)(xi)胞(bao)質(zhi)量(liang)是影響轉(zhuan)染(ran)效果的重(zhong)要因素(su)之(zhi)一。（傳代）細(xi)(xi)胞(bao)狀態良好(hao)，處于對數生(sheng)(sheng)長(chang)期(qi)的細(xi)(xi)胞(bao)轉(zhuan)染(ran)效果最佳(jia)（對于每個細(xi)(xi)胞(bao)來說，倍增(zeng)時間越(yue)短(duan)，轉(zhuan)染(ran)效率越(yue)高）。因此，使(shi)用高質(zhi)量(liang)細(xi)(xi)胞(bao)系是保(bao)證生(sheng)(sheng)產指(zhi)標的一項重(zhong)要因素(su)。
細胞在經過長時間（數年）傳代之后往往會經歷突變、染色體重組或基因調控改變等，這可能會導致細胞的行為發生改變，影響原有的細胞功能。也就是說，在一株細胞系經過數百甚至數千次傳代之后，與相同細胞系低代次的細胞相比其生物學性狀可能會發生不同程度的改變，其中一些改變可能導致與轉染相關的細胞行為受到影響。一般來說，低細胞代數能確保基因型不變。最適合轉染的細胞是經過幾次傳代后達到指數生長期的細胞，此時細胞生長旺盛，最容易轉染（圖2）。同時，小編建議在進行抗體/病毒生產時，所轉染細胞的傳代數最好不超過30代。因此，如果發現轉染效率降低，可以試著轉染新復蘇的細胞以恢復最佳結果。
另外(wai)，如果選擇貼壁(bi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)來(lai)執行(xing)生產任(ren)務(wu)，那么(me)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)匯合(he)度是影響轉染(ran)的因(yin)(yin)素之一。細(xi)(xi)(xi)胞(bao)需(xu)要(yao)一定(ding)的匯合(he)水平(ping)才能(neng)發揮最佳作用。事實上，這是因(yin)(yin)為細(xi)(xi)(xi)胞(bao)間所發生的相(xiang)互作用，換句(ju)話說，細(xi)(xi)(xi)胞(bao)之間的直(zhi)接接觸(chu)和細(xi)(xi)(xi)胞(bao)通(tong)訊，以(yi)及(ji)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)和細(xi)(xi)(xi)胞(bao)之間通(tong)過分泌因(yin)(yin)子進行(xing)的細(xi)(xi)(xi)胞(bao)交流(liu)，是保證(zheng)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)生長和分裂(lie)的基本需(xu)求，也是保證(zheng)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)高質量生長的關鍵要(yao)素。
總之，細胞的(de)各項指標，包(bao)括倍增時(shi)間、傳代(dai)次數和細胞匯合水平等都可能改(gai)變細胞的(de)生(sheng)物學行(xing)為，從而(er)對轉(zhuan)染產生(sheng)一(yi)定程度(du)的(de)影(ying)響。在(zai)轉(zhuan)染時(shi)最(zui)好選用處于對數生(sheng)長(chang)期，活力高，代(dai)次低（30代(dai)以內）的(de)細胞進行(xing)轉(zhuan)染。
Fig.2 使用相(xiang)同參數轉染(ran)低、中、高傳代細胞(bao)，以確定細胞(bao)培養代次是(shi)否(fou)影響轉染(ran)效率和(he) rAAV 生(sheng)產。
4、細胞密(mi)(mi)度：推薦(jian)在1~3×106cells/ml進行優化, 也(ye)可嘗試高細胞密(mi)(mi)度，比如4/5×106cells/ml
在懸浮培養條件下，培養基中細胞密度與細胞本身的狀態息息相關。在細胞密度較低的情況下，細胞有更多的空間和養分供應，因此可以更快地生長和繁殖。但當細胞密度過低時往往由于細胞與細胞之間相互作用降低導致細胞分化，影響細胞功能，降低轉染效果及產毒能力。在細胞密度過高時，細胞之間又會發生競爭，養分和空間變得有限，導致細胞代謝降低、生長速率減緩。此外，乳酸是細胞代謝的副產物，乳酸對細胞具有毒性作用，高密度培養情況下會導致培養基中乳酸不斷積累，影響細胞狀態，降低細胞活力，影響轉染效率及抗體/病毒產量。因此，細胞密度應該適當控制，以保證細胞的生長速率和細胞數量的平衡。小編建議在進行轉染前將細胞密度控制在2 × 106cells/ml左右為宜，用戶也可根據自身需要對細胞密度進行優化，推薦優化范圍為1~3 × 106cells/ml；如需更高細胞轉染密度（比如4/5 × 106cells/ml），客戶可根據需求進一步對相關參數進行調整，小編建議高細胞密度轉染時適當降低質粒用量。
5、質(zhi)粒及用量：1~2μg/1×106細胞(bao)，高細胞(bao)密度時（如 5×106cells/ml）需要酌情考慮(lv)降低DNA用量，比如0.4μg/1×106細胞(bao)
在進(jin)行轉染(ran)操作時(shi)，高(gao)質量的質粒（高(gao)純(chun)度、無菌(jun)、無內毒素）DNA對于轉染(ran)至關重要。由(you)于轉染(ran)基于正負電(dian)荷相互吸引的原理，如果DNA不純(chun)，如帶(dai)少量的蛋(dan)白(bai)質、鹽離子、細胞代謝物(wu)等都會顯著(zhu)影響(xiang)轉染(ran)復合(he)物(wu)的有效(xiao)形成(cheng)，進(jin)而影響(xiang)轉染(ran)效(xiao)率。
一般通過檢測質粒的吸光度（OD值）來判斷質粒的質量。OD值A260 / A280值大于或等于1.8，意味著該質粒DNA是純的；A260 / A280小于1.8，表明樣品可能存在酚類（苯酚）或蛋白質污染；讀數大于2.0，則表明樣品被RNA污染。小編建議對于轉染所用質粒其OD值最好位于1.8~1.95之間。除此之外，在質粒DNA抽提時，內毒素一定要清除干凈。內毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁中的一種成分，很穩定，需要很長時間高溫或強化試劑才能清除干凈，對宿主是有毒性的。內毒素清除的效果，是決定能否有效轉染的關鍵指標，當內毒素水平過高時，即使選用高濃度質粒DNA也無法獲得理想的轉染效果。
質粒用量：在正常情況下（低細胞密度），為了增加轉染效率，實驗人員在轉染時或許更傾向于添加過量的質粒DNA，但是要注意的是，在轉染過程中質粒DNA用量過少的確會影響轉染效果，導致產量下降，但是質粒DNA量過多同樣會降低轉染效率。所以在進行規模放大之前，對質粒DNA用量應進行系列優化探索，以期達到理想的轉染效果。對此小編建議在轉染時，質粒用量首先推薦1μg / 1 × 106cells，用戶后續可根據自身情況對質粒用量進行優化，推薦優化范圍為1~2μg / 1 × 106cells。當使用高細胞密度(如5 × 106cells/ml)進行生產時，質粒用量應隨之改變，一般在高密度下質粒用量推薦在0.4~0.6μg/ 1 × 106cells。
6、總結
除以上因素之外，轉染中還會有多種其它因素，如質粒比例、PEI用量、收集時間等因素影響生產產量，因此在進行蛋白/病毒生產時最好按需對多種條件進行優化，以達到最好的生產結果。讀者可關注曼博生物（Mine-bio)微信公眾號了解更多轉染相關注意事項及后續細胞轉染優化方向（二）。
主要參考文獻
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3. Comparison of highly pure rAAV9 vector stocks produced in suspension by PEI transfection or HSV infection reveals striking quantitative and qualitative differences.
4. A feasibility study of different commercially available serum?free mediums to enhance lentivirus and adeno?associated virus production in HEK293 suspension cells.
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6. Non-Viral in Vitro Gene Delivery: It is Now Time to Set the Bar!
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